[发明专利]一种EV71病毒的化学发光免疫成像检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种手足口病主要致病病原EV71病毒的检测方法，属于免疫检测技术领域和化学发光免疫分析技术领域。肠道病毒EV71-HB0803株由中国典型培养物保藏中心保藏（地址：武汉大学生命科学学院，武汉市武昌珞珈山，430072），保藏日期是2010年9月30日，保藏号是CCTCC NO：V201020。

背景技术

肠道病毒71型( Enterovirus 71，EV71) 为手足口病( hand-foot-mouth disease，HFMD) 主要病原体，属于小RNA 病毒科，肠道病毒属成员，其基因组为约7408个核苷酸的单股正链RNA。EV71病毒常在婴幼儿中引起手足口病的大范围暴发流行，并能导致重症、甚至死亡病例的发生。1998年中国台湾地区129106例的手足口病例及78例死亡主要由EV71引起，2008年和2009年以EV71感染为主引起的手足口病在中国大陆多个省市流行，并导致数百名儿童死亡。这些手足口病疫情使越来越多的研究针对EV71的病原检测、致病机制、病毒变异与毒力以及疫苗开发。国家卫生部于2008年5月首次将手足口病列入《中华人民共和国传染病防治法》规定的丙类传染病进行管理，并于5月下发了《手足口病实验室检测方案(试行) 》，其中介绍了病毒分离、双份血清标本的中和抗体滴度测定、逆转录-聚合酶链反应(RT- PCR) 等3种检测方法。

化学发光(Chemiluminescence，简称CL)，即化学发光物质经催化剂的催化或氧化剂的氧化后，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子，可以利用发光测量仪测量光量子产额。它具有灵敏度高、线性范围宽和仪器设备简单等特点。20世纪60年代初，Yallow和Berson创建了具有划时代意义的放射免疫分析技术(Radioimmunoassay, 简称RIA)，因其高灵敏度和高特异性，开创了生物医学的微量物质分析的新领域。但该方法也存在一些弱点，如污染环境，影响工作人员健康等。化学发光免疫分析（Chemiluminescence immunoassay，简称CLIA）是在RIA 基本理论的基础上，以标记发光试剂为示踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法。经过多年的发展，研究者利用许多新材料、新技术、新工艺，加速了CLIA 的完善。目前，化学发光法作为一种研究和应用比较活跃的分析方法，具有灵敏度高、线性范围宽、分析速度快、仪器设备简单以及易于实现自动化等特点。作为一种高灵敏的分析方法，其选择性却较差，往往受到较大的干扰。故在实际应用中，常常选择与其它分离技术或具有特异性的反应相结合。CLIA结合了化学发光的高灵敏度和免疫反应的高特异性的特点，已广泛应用于多种药物、激素、病原微生物、抗原及其他生物活性物质的测定。如CLIA法检测甲胎蛋白(AFP)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、克伦特罗、氯霉素、 肝类表面抗原和其它物质。

卫生部在《手足口病实验室检测方案(试行) 》中介绍了病毒分离、双份血清标本的中和抗体滴度测定、逆转录-聚合酶链反应(RT- PCR) 3种检测方法。我国目前已经申请的EV71病毒检测相关的专利技术有8项，包括了EV71病毒核酸的RT- PCR检测方法、利用单克隆抗体的ELISA检测方法等，还未见本发明所述的基于磁性微球分离化学发光免疫成像的EV71病毒检测方法。现有的病毒检测技术存在以下几个弱点：一是样品处理难度大，比如病毒核酸的提取，特别是病毒RNA的提取，对实验条件和操作人员的要求很高，否则很容易引起核酸的降解，从而导致检测结果的假阴性。二是实验所需时间较长，病毒核酸检测至少要数小时甚至更长。三是实验操作复杂且需要特殊的仪器设备。对比卫生部公布的参考检测方法和已经申请的专利技术，本发明所述基于磁性微球分离化学发光免疫成像的EV71病毒检测方法有十分明显的优势，比如样品处理简单、操作要求不高、快速、灵敏度高等特点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：为克服现有技术的缺陷，提供一种基于磁性微球富集作用与化学发光检测于一体的、特异性强、检测方法更加可靠的适用于检测EV71病毒的方法，

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的是一种基于磁性微球分离和化学发光免疫成像的EV71病毒检测方法，该方法包含以下步骤：

（1）在磁性微球的表面偶联EV71病毒的兔抗多克隆抗体；

（2）将偶联有抗体的磁性微球加入检测样品，孵育后利用磁铁分离，去除上清，用PBSTB缓冲液洗涤；