[发明专利]一种EV71病毒的化学发光免疫成像检测方法

权利要求书

1.一种EV71病毒的化学发光免疫成像检测方法，其特征是一种基于磁性微球分离和化学发光免疫成像的EV71病毒检测方法，该方法包含以下步骤：

（1）在磁性微球的表面偶联EV71病毒的兔抗多克隆抗体；

（2）将偶联有抗体的磁性微球加入检测样品，孵育后利用磁铁分离，去除上清，用PBSTB缓冲液洗涤；

（3）加入生物素化的EV71 VP1重组蛋白的兔抗多克隆抗体，孵育后利用磁铁分离，去除上清，用PBSTB缓冲液洗涤；

（4）加入SA-HRP，孵育后利用磁铁分离，去除上清，用PBSTB缓冲液洗涤后转移微球至新的微孔板中；

（5）加入HRP化学发光底物，把反应后待检测的磁性微球置放于凝胶成像仪中进行测量，考察化学发光强度的对数与待测样品抗体浓度的对数之间的线性关系；

经过上述步骤，实现EV71病毒的化学发光免疫成像检测。

2.根据权利要求1所述的EV71病毒的化学发光免疫成像检测方法，其特征在于步骤（1）中所述兔多克隆抗体由EV71病毒株HB0803  CCTCC NO：V201020免疫家兔，抗血清经硫酸铵沉淀和proteinA纯化得到。

3. 根据权利要求1所述的EV71病毒的化学发光免疫成像检测方法，其特征在于步骤（3）中所述VP1重组蛋白的兔抗多克隆抗体通过以下方法获得：

先根据EV71病毒标准株BrCr-TR株基因组GenBank: AB204852.1设计一对引物VP1-F和VP1-R，然后以EV71病毒株HB0803  CCTCC NO：V201020基因组为模板，扩增VP1基因，重组蛋白由VP1基因克隆至PET-32a载体中以后原核表达，免疫家兔后，所得抗血清经硫酸铵沉淀和proteinA纯化得到，

VP1-F引物的序列：GAGAGTTCTATAGGGGACAGT，

VP1-R引物的序列：AGCTGTGCTATGTGAATTAGGAA。

4.根据权利要求1所述的EV71病毒的化学发光免疫成像检测方法，其特征在于步骤（2）和步骤（3）所述PBSTB缓冲液为含有0.01 M PBS, 0.1% Tween 20, pH 7.4的缓冲液。

5.根据权利要求1所述的EV71病毒的化学发光免疫成像检测方法，其特征在于步骤（1）中所述兔抗多克隆抗体采用以下方法获得：利用RD细胞扩增EV71病毒株HB0803，然后经收集后超速离心浓缩病毒，免疫健康家兔，制备高免血清，对高免血清采用饱和硫酸铵沉淀法进行粗提，经proteinA过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG抗体。

6.根据权利要求1所述的EV71病毒的化学发光免疫成像检测方法，其特征在于使用凝胶成像系统检测化学发光成像信号，并对病毒进行定量分析，该方法是：把反应后的磁性微球转移至黑色聚苯乙烯微孔板中，并于凝胶成像仪中进行测量；加入50 μL 化学发光液，采用化学发光高灵敏模式, 2 min后开始曝光，曝光时间设定为5 min；获得的图片用仪器自带的Quantity One软件进行处理，其化学发光强度值为扣除空白对照后的平均光密度值。