[发明专利]一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法

权利要求书

1.一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法，其特征在于：采用PCR技术将L-苯丙氨酸的原始工程质粒MDphe-2构建成新一代工程质粒MDphe-3；并通过Red系统对该工程质粒MDphe-3的工程宿主菌的整体代谢网络调控基因csrA进行缺失构建；然后将工程质粒MDphe-3植入整体代谢网络调控基因csrA缺失的工程宿主菌内以构建新的L-苯丙氨酸基因工程菌；最后对该新的L-苯丙氨酸基因工程菌的遗传稳定性及产酸进行验证。

2.如权利要求1所述一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法，其特征在于：包括以下几个步骤：

步骤一：将设计的带有酶切位点的pckA基因采用PCR技术进行扩增；

步骤二：将步骤一扩增后所获得的pckA基因进行电泳回收，并对回收的片段采用T-A克隆法克隆，且将连接后的阳性克隆载体进行连接方向筛选，以获得PMDpckA载体；

步骤三：通过在PMDpckA载体中融合温控启动子Pl序列及T7强终止子序列，最终获得pckA基因的完整表达元件；

步骤四：将L-苯丙氨酸的原始工程质粒MDphe-2进行序列分析，接着在该工程质粒MDphe-2的1293bp位点处进行平末端化后再串联插入平末端化后的pckA基因完整表达元件，以构建新一代工程质粒MDphe-3；

步骤五：采用Red系统的同源重组功能对工程质粒MDphe-3的工程宿主菌整体代谢网络调控基因csrA进行缺失；

步骤六：将工程质粒MDphe-3植入csrA基因缺失的工程宿主菌当中进行表达，以完成新的L-苯丙氨酸基因工程菌的构建；并对该新的L-苯丙氨酸基因工程菌的遗传稳定性及产酸进行验证。

3.如权利要求2所述一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法，其特征在于：所述步骤三的具体操作如下：

取PMDpckA载体与PBV220质粒通过酶切法构建PBVpckA载体，之后取该PBVpckA载体与pET28a质粒通过酶切法构建pETpckA28载体；然后将该pETpckA28载体作为模板，并设计一对融合PCR的引物；接着把该模板及引物混合后进行PCR扩增，获得完整的pckA基因表达元件，最后通过T-A克隆法及酶切法验证所获得的pckA基因表达元件的完整性。

4.如权利要求2所述一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法，其特征在于：所述步骤四的具体操作如下：

(1)完整的pckA基因表达元件及L-苯丙氨酸的原始工程质粒MDphe-2的预处理：

A.采用PCR技术对完整的pckA基因表达元件进行扩增，扩增过程以载体pETpckA28为模板，并利用融合PCR引物进行扩增；PCR扩增结束后用Dpn I酶在37℃下处理1h，消化PCR扩增的模板；最后对目的片段进行电泳回收，回收片段即为平末端的完整的pckA基因表达元件；

B.将L-苯丙氨酸的原始工程质粒MDphe-2进行序列分析，并将该工程质粒MDphe-2进行单酶切消化反应，反应结束后对其进行电泳回收，以及平末端化处理，回收片段即为平末端缺口MDphe-2核苷酸片段；

(2)新一代工程质粒MDphe-3的构建：

A.将回收的完整的pckA基因表达元件的平末端及含平末端缺口的MDphe-2核苷酸片段采用连接酶进行连接反应，且该反应于16℃下进行并过夜，反应结束后先在冰中放置15min后，取10μl直接转化成感受态E.coliJM109细胞，并对该感受态E.coli JM109细胞进行LB+Kana抗性平板筛选，获得阳性克隆菌株；

B.取获得的阳性克隆菌株进行质粒抽提，并进行Sty I酶切验证，酶切结束后进行电泳，电泳结果显示除含完整的pckA基因表达元件的平末端片段外，同时还有另一质粒片段，即为新一代工程质粒MDphe-3。