[发明专利]6-磷酸葡萄糖脱氢酶和(S)-羰基还原酶偶联提高(S)-苯基乙二醇转化效率的方法

权利要求书

1.一株不对称制备(S)-苯基乙二醇的重组菌，其分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）SCRⅡG ，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.4198。

2.利用重组菌CGMCC No.4198不对称转化制备 (S)-苯基乙二醇的方法，其特征在于不对称转化反应条件：在0.1 mol/L pH 5.5的醋酸缓冲液中，加质量/体积比5%葡萄糖，底物2-羟基苯乙酮的浓度为6 mg/mL，重组菌细胞浓度为0.1 g/mL，不加辅助底物，反应温度为35℃，反应时间为24 h，转速150 r/min，重组菌菌体重复利用十个批次。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于重组菌的培养

BMGY培养基，以质量/体积%计：酵母膏1%，蛋白胨2%， 甘油1%，pH 6.0、100 mmol/L磷酸缓冲液10%，YNB 1.34%，生物素4×10^-5 %，用去离子水补足至100%；

BMMY培养基，以质量/体积%计：酵母膏1%，蛋白胨2%，甲醇0.5%， pH 6.0、100 mmol/L磷酸缓冲液10%，YNB 1.34%，生物素4×10^-5 %，用去离子水补足至100%；

培养条件：将重组菌CGMCC No.4198按1%的接种量接种于装有25 mL BMGY培养基的100 mL摇瓶中，在28℃、250 r/min的条件下，培养至菌浓OD₆₀₀=2-6；室温3000 g离心5 min，收集菌体，用100 mL BMMY重悬菌体，使OD₆₀₀为1.0，置于500 mL的摇瓶中，在28℃、250 r/min的条件下培养，每12 h，按培养基质量/体积%计添加甲醇0.5%至培养基中，培养96h，10,000 rpm离心10 min，沉淀用生理盐水洗涤两次，收集得到重组菌全细胞。

4.权利要求1所述重组菌CGMCC No.4198的构建方法，其特征在于将scrⅡ基因插入pPIC3.5K中构建重组质粒pPIC3.5K-SCRⅡ，电击转化毕赤氏酵母GS115感受态细胞，获得重组菌Pichia pastoris/pPIC3.5K-SCRⅡ；同时将基因ZWF1插入载体pPICZα，获得重组质粒pPICZα-ZWF1，用SacI对 pPICZα-ZWF1进行单酶切线性化，电转化感受态重组毕赤酵母Pichia pastoris/ pPIC3.5K-SCRⅡ的感受态细胞，涂布含有100 μg/mL Zeocin的YPD平板，挑取阳性单克隆得到重组菌Pichia pastoris/SCRⅡG。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征是重组质粒pPIC3.5K-SCRⅡ的构建：利用限制性内切酶BamH I和Not I分别对载体pPIC3.5K和基因片段scrⅡ进行酶切，纯化后的基因片段与载体通过粘性末端进行连接，获得重组质粒pPIC3.5K-SCRⅡ。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征是重组质粒pPICZα-ZWF1的构建，利用限制性内切酶BstB I 和Xho I分别对载体pPICZα和基因片段ZWF1进行

酶切，纯化后的基因片段与载体通过粘性末端进行连接，获得重组质粒pPICZα-ZWF1。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征是基因片段scrⅡ的获取：实验室已知scrⅡ基因全序列，以近平滑假丝酵母的基因组为模板，设计含有

BamH I酶切位点的引物SCRⅡ_pPIC3.5K_F和含有NotI酶切位点的引物SCRⅡ_pPIC3.5K_R，通过PCR，获得scrⅡ基因全长。