[发明专利]一种水溶性菁染料Cy5.5的制备及纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物合成技术领域，特别是一种水溶性菁染料Cy5.5的制备及纯化方法。

背景技术

菁染料是指发色团共轭体系两端建立在N-N原子间的脒离子插烯物，具有较好的平面刚性结构或大的平面共扼体系，荧光量子产率高，荧光波长长，能很好地与DNA自身的淡蓝色荧光相区别，而且与DNA作用后荧光量子产率增强。因而，菁染料得到了人们越来越多的重视。

水溶性菁染料是性能优良的荧光标记染料，广泛用于抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。通过改变次甲基链的长度，可改变其荧光发射波长。Amershan Pharmacia Biotech公司首先将荧光发射波长不同的水溶性含磺酸基菁染料应用于基因芯片的双色荧光检测，目前已有商品化的成套仪器和试剂出售，并注册了Cy3，Cy5商标名，其商品化的菁染料与核苷连接物售价竟高达500美元/毫克，价格昂贵。菁染料已成为基因芯片测试用的首选荧光标记物，但由于菁染料，尤其是不对称菁染料的合成副反应多，副产物极性相近，产物的分离提纯相当困难。水溶性菁染料分子极性大，分离提纯越加困难。文献报道用HPLC(C-18反相柱)纯化，而国内实验室一般没有相应的条件。

吲哚类水溶性菁染料Cy3.5，Cy5.5，Cy7.5等是生物芯片、分子信标常用的荧光染料，但是基于上述制备，分离困难等原因，且至今尚无相应的合成文献报道。为了解决吲哚菁染料在国内需求长期依赖进口的现状，我们探索合成并用薄层色谱法分离提纯出Cy5.5，该方法操作简单，中间体不需分离，后续分离简便，摒弃了价格昂贵的HPLC(C-18反相柱)纯化方法，不仅填补了Cy5.5在的合成文献方面的空白，而且对于实现Cy5.5在国内的生产及应用具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术分析，提供一种水溶性菁染料Cy5.5的制备及纯化方法，该方法操作简单、成本低，对于实现Cy5.5的国产化具有重要的现实意义。

本发明的技术方案：

一种水溶性菁染料Cy5.5的制备及纯化方法，步骤如下：

1)将1，3-二磺酸-6-萘肼、甲基异丙基甲酮和醋酸钾加入醋酸中，常压下进行回流反应，产物经甲醇提纯得到1，1，2-三甲基苯并吲哚1，3-二磺酸盐；

2)将上述制得的1，1，2-三甲基苯并吲哚1，3-二磺酸盐加入碘乙烷和邻二氯苯中，在氮气保护下进行反应，反应温度为90℃-130℃，反应时间为24h，生成N-乙基-2，3，3-三甲基苯并吲哚5，7-二磺酸盐，然后将生成物以正丁醇和醋酸的水溶液为展开剂，用制备薄层色谱分离提纯；

3)将1，1，2-三甲基苯并吲哚1，3-二磺酸盐加入6-溴己酸和邻二氯苯中，在氮气保护下进行反应，反应温度为140℃，反应时间为24h，生成N-(ε-羧戊基)-2，3，3-三甲基苯并吲哚-5，7-二磺酸盐，然后将生成物以正丁醇和醋酸的水溶液为展开剂，用制备薄层色谱分离提纯；

4)将N-乙基-2，3，3-三甲基苯并吲哚-5，7-二磺酸盐和β-苯胺基丙烯醛缩苯胺盐酸加入醋酸酐与醋酸混合液中，在氮气保护下进行反应，反应温度为100℃-130℃，反应时间为3-4h，生成中间体N-乙基-2-(δ-苯胺基甲基乙酮基)丁烯基-3，3-二甲基苯并吲哚-5，7-二磺酸盐；

5)将N-(ε-羧戊基)-2，3，3-三甲基苯并吲哚-5，7-二磺酸盐、醋酸酐、醋酸和醋酸钾依次加入到N-乙基-2-(δ-苯胺基甲基乙酮基)丁烯基-3，3-二甲基苯并吲哚-5，7-二磺酸盐中，在氮气保护下进行反应，反应温度为100℃-140℃，反应时间为0.5-1h，生成水溶性菁染料Cy5.5的初级产品；

6)水溶性菁染料Cy5.5初级产品的分离提纯采用制备薄层色谱法，反复展开，得到3条蓝色展开带，取中间的蓝色带经淋洗、浓缩后，即可制得水溶性菁染料Cy5.5的纯品。

所述步骤1)中1，3-二磺酸-6-萘肼、甲基异丙基甲酮和醋酸钾加入醋酸中的用量摩尔比为1∶3∶3；甲基异丙基甲酮与醋酸的体积比为1∶4-6。

所述步骤2)中1，1，2-三甲基苯并吲哚1，3-二磺酸盐加入碘乙烷的摩尔比为1∶10-20；展开剂中正丁醇、醋酸与水的体积比为4∶1∶2。

所述步骤3)中1，1，2-三甲基苯并吲哚1，3-二磺酸盐与6-溴己酸的摩尔比为1∶2-5；展开剂中正丁醇、醋酸与水的体积比为4∶1∶2。