[发明专利]一种结核分枝杆菌复合群的荧光定量RT-PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程检测技术领域，具体涉及临床标本中结核分枝杆菌复合群的荧光定量检测方法。  

背景技术

结核分枝杆菌复合群包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌。结核分枝杆菌是引起人类结核病的主要病原菌，此外，牛分枝杆菌除引起牛结核病外，少数人类结核病也由其引起。非洲分枝杆菌致病力较弱，是热带非洲人结核病病原体。田鼠分枝杆菌对人类无致病性。

结核病是严重危及全球的公共卫生问题之一，自20世纪90年代以来结核病在全球“死灰复燃”，许多国家包括结核病疫情控制较好的国家，不同程度地出现了疫情下降缓慢或严重反弹的局面，发病率以每年1.1％的速度增长，结核病再次成为威胁人类健康的主要传染病，成为严重的公共卫生问题和重大的经济社会问题。据世界卫生组织估计，全球每年新发结核病患者880万例，其中传染性结核病患者390万例，每年因结核病死亡的患者约200万人。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，患者人数仅次于印度居全球第二位。每年因结核病死亡人数达13万，大大超过其他传染病死亡人数的总和。如果不采取有效措施，在未来的10年中，可能有3000万人发生结核病。 

临床诊断肺结核的主要依据是检测痰中结核分枝杆菌，其中，涂片法简单易行，但阳性率较低；罗氏培养法虽然是金标准，但检测周期长，均难以满足临床需要。因此提供敏感、特异、快速、可靠、简便、适合临床应用的实验室检查技术已成为国内外研究的重点。其中实时荧光PCR因其技术成熟，具有较高的灵敏性和特异性，已逐步应用到临床中。

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一个特异性荧光探针（TaqMan探针），探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程。目前常用的TaqMan探针为寡核苷酸，其5′端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，每个循环结束后检测一次荧光强度，整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及未知模板的扩增曲线可对未知模板进行定量分析。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的缺陷，提供一种检测灵敏度高、且操作简单的结核分枝杆菌复合群的荧光定量RT-PCR检测方法。

本发明提供的结核分枝杆菌复合群的荧光定量RT-PCR检测方法，通过对RDP ( Ribosomal Database Project)中结核分枝杆菌复合群的16srRNA全序列进行生物信息学比对分析,选取序列保守片段为靶目标，应用primer express软件和primer premier 5.0软件，设计一条逆转录引物和一对PCR引物以及一条Taqman探针。本发明方法所用的结核分枝杆菌复合群特异性定量检测试剂包含一条逆转录引物和一对特异性PCR引物以及一条特异性荧光探针，扩增目的扩增片段长度为100 bp。 

本发明方法包括如下步骤：

1.通过生物信息学分析，选择结核分支杆菌复合群的16srRNA基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：

GGGATGCATGTCTTGTGGTGGAAAGCGCTTTAGCGGTGTGGGATGAGCCCGCGGCCT ATCAGCTTGTTGGTGGGGTGACGGCCTACCAAGGCGACGACGG    （SEQ ID NO.5）

2.应用primer express软件和primer premier 5.0软件，设计一条结核分支杆菌复合群的逆转录引物和一对PCR引物以及一条Taqman探针。探针5'端的荧光报告基团是FAM，3'端标记的是荧光淬灭基团为TAMRA。

逆转录引物：CCGTATCTCAGTCCCAGTGT        (SEQ ID NO.1)

上游引物：MTBC-F: GGGATGCATGTCTTGTGGTG  (SEQ ID NO.2)

下游引物：MTBC-R: CCGTCGTCGCCTTGGTAG    (SEQ ID NO.3)