[发明专利]一种结核分枝杆菌复合群的荧光定量RT-PCR检测方法无效

申请号：	201010522800.1	申请日：	2010-10-28
公开（公告）号：	CN101974630A	公开（公告）日：	2011-02-16
发明（设计）人：	姜丽娟;李瑶;吴伟	申请（专利权）人：	复旦大学
主分类号：	C12Q1/68	分类号：	C12Q1/68;C12Q1/06;C12N15/11;G01N21/64
代理公司：	上海正旦专利代理有限公司 31200	代理人：	陆飞;盛志范
地址：	200433 ***	国省代码：	上海;31
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摘要：
搜索关键词：	一种结核分枝杆菌复合荧光定量 rt pcr 检测方法
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【权利要求书】：

1.一种结核分枝杆菌复合群的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)结核分枝杆菌复合群特异性定量RT-PCR引物和探针设计

在RDP核糖体序列分析数据库中检索结核分枝杆菌复合群的16srRNA全序列，通过生物信息学比对分析,选取序列保守片段，设计一条逆转录引物和一对PCR引物以及一条Taqman探针，探针5'端的荧光报告基团是FAM，3'端标记的是荧光淬灭基团为TAMRA，引物和探针位于结核分枝杆菌复合群16srRNA区域，目的扩增片段为100 bp，扩增序列为：

GGGATGCATGTCTTGTGGTGGAAAGCGCTTTAGCGGTGTGGGATGAGCCCGCGGCCT

ATCAGCTTGTTGGTGGGGTGACGGCCTACCAAGGCGACGACGG

引物和探针序列为：

逆转录引物：CCGTATCTCAGTCCCAGTGT

上游引物：MTBC-F: GGGATGCATGTCTTGTGGTG

下游引物：MTBC-R: CCGTCGTCGCCTTGGTAG

Taqman探针序列：5'-FAM-CGGGCTCATCCCACACCGCTA-TAMRA-3'；

(2)定量标准品的构建

根据确定的PCR产物，利用DNA重组技术将包含目的扩增片段的基因克隆到质粒载体pGEM-T Easy 中，构建的重组质粒作为检测结核杆菌复合群的定量标准品；

(3)样本中结核分枝杆菌复合群的分离及其核酸的提取，使提取的样本中同时含有DNA与RNA成分；

(4)对提取的同一例样本分别进行RT-PCR和PCR，计算出起始样本中RT-PCR/PCR的拷贝数比值，从而区分样本中死菌与活菌。

2.一种结核分枝杆菌复合群特异性定量RT-PCR引物和探针，扩增序列为：