[发明专利]溶酶体靶向的荧光物质及其合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种溶酶体靶向的荧光物质及其合成方法，属于细胞成像领域。

背景技术

现代细胞显微光学成像技术及细胞器精细功能研究的发展，要求具有高效率，高灵敏度且具有细胞器靶向作用的荧光试剂的开发和应用。细胞以及细胞器的显微成像，甚至细胞器精细功能的可视化动态标示，一直是现代显微成像的重点和难点，为人类各种疾病和细胞衰老提供直观的科学依据，具有极其重要的生物学意义和新药开发价值。

细胞器一股并没有明确有效的靶点，能够实现特定细胞器的靶向作用的化学小分子很稀少。目前这一领域正成为国内外研究的热点，并具有重大的学术意义和应用价值。目前为止，以特定细胞器为靶点，如线粒体，溶酶体以及高尔基体等，能够在活体细胞中作用于这些靶点的，应用比较成熟的有染料和抗体两类。一股染料都会有光漂白性和光致毒性，在紫外可见光的照射下短时间内即失去荧光活性，或者产生单线态氧等极易对活细胞发生毒害作用的物质，不利于活体细胞的无损伤成像；抗体虽然低毒，但是其昂贵的价格和容易失活的缺点限制了抗体的细胞成像应用。而且染料和抗体本身可供选择的范围也比较小，无论是在荧光激发和发射范围还是在细胞器靶向作用方面，都无法满足科研和实际应用的需要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效、低毒、溶酶体靶向的荧光物质及其合成方法。

本发明的技术方案是：

一种溶酶体靶向的荧光物质，结构式如下：

上述物质可以在紫外光下激发，也可以在近红外光区双光子激发，产生可见光荧光发射。通过活细胞实验证实，上述荧光物质能够特异性的作用于溶酶体，实现溶酶体的清晰成像。

上述荧光物质的合成方法：以4-溴苯胺和多聚甲醛为原料，以三氟乙酸作为溶剂和反应催化剂，0～25℃反应得到中间体5，11-二溴-[1，5二氮芳辛]二氮杂环辛间四烯，再用Heck反应将中间体中的溴以4-乙烯基-N，N-二甲基苄胺取代。

反应路线如下：

多聚甲醛中的n为正整数。

上述荧光物质的合成方法，更具体地为：

按4-溴苯胺：多聚甲醛摩尔比为1∶2～2.5的比例，将4-溴苯胺和多聚甲醛均匀混合在一起，滴加入过量的三氟乙酸作为溶剂和反应催化剂，然后在0～25℃反应70～160个小时；

将反应溶液中和至pH值为7～8，用有机溶剂萃取，将有机溶剂蒸干大部分，结晶为中间体5，11-二溴-[1，5二氮芳辛]二氮杂环辛间四烯；

以中间体摩尔量为基准，加入2.4～3.0倍的4-乙烯基-N，N-二甲基苄胺，还加入5～10％的醋酸钯作为催化剂，10～20％的三苯基磷作为配体，以及4～6倍的碳酸铯作为碱，以无水N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，在氮气保护下加热到137℃反应8～10个小时，分离得到荧光物质。

本发明涉及的上述荧光物质，是一种轴对称的化合物分子。以化合物分子中的碳碳双键(CH＝CH)为分割点，碳碳双键靠近分子对称轴的一侧和碳碳双键远离分子对称轴的一侧互为电子跃迁的给体和受体，通过碳碳双键这个共轭结构连接起来。分子在紫外光激发或者近红外光区双光子激发下，电子跃迁离域范围扩大，分子从激发态返回基态的过程中，发射肉眼可见的荧光。这种荧光物质分子的生物活性基团为N，N-二甲基苄胺基团，即分子中在碳碳双键远离对称轴一侧的基团。这个生物活性基团具有靶向细胞溶酶体的作用。

在细胞实验中，向细胞培养基中加入2-10μmol/L浓度的荧光物质溶液，并培养细胞2～8小时，采用405nm波长的激光光源照射细胞，可以清晰的看到细胞中溶酶体的形态；或者采用790nm波长激光光源照射细胞，在双光子荧光成像模式下，可以观察到细胞中溶酶体的清晰形态。

本发明所述荧光物质通过生物活性基团N，N-二甲基苄胺基的靶向作用到达细胞溶酶体内，在紫外光激发或者近红外区双光子激发下，发射肉眼可见荧光，清晰的显现出细胞内溶酶体的形态，细胞中除溶酶体之外的位置没有荧光发射。据此，本发明所述荧光物质可以用作细胞溶酶体成像剂。

本发明方法有效应用Heck反应，合成路径简单，产率较高，得到的产物性质稳定，具有可见光荧光发射以及溶酶体靶向作用。细胞实验证实，该化合物能够靶向进入细胞溶酶体，在紫外光激发或者近红外光区双光子激发下都得到清晰的细胞溶酶体影像。

附图说明

图1Hela细胞加入荧光物质后成像；

图2Hela细胞加入溶酶体染色剂LT Red后成像；

图3Hela细胞加入荧光物质和LT Red后共定位成像。

具体实施方式