[发明专利]牛血清中分支杆菌抗体的ELISA检测方法及抗原

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的检测方法及抗原，具体是一种牛血清中分支杆菌抗体的ELISA(利用结核分支杆菌分泌蛋白建立酶联免疫吸附法)检测方法及抗原。

背景技术

近年来，ELISA对结核病人血清中抗结核杆菌抗体进行检测，从而确定人体内分支杆菌感染状态。这种方法虽然取得了较为理想的效果，显示出良好的应用前景，但就目前而言，该方法在牛分支杆菌感染检测方面还没有很好的应用。

牛分支杆菌(Mycobacterium bovis)是引起人兽共患的慢性消耗性传染病---牛结核病的一种致病菌，可通过病畜传染给人类或其他动物，严重危害人类的健康和畜牧业的发展并且导致很大的经济损失。至今，牛结核病所造成的损失大于牛的其他各种疾病所造成损失的总和。患牛结核病的奶牛是人结核病的重要传染源。现在控制人结核病的一种重要手段是对奶牛进行牛分支杆菌感染检测，然后对检测出的阳性牛进行隔离或捕杀。但是，由于牛分分支菌致病机制复杂，给其感染检测造成很大的困难，使得牛结核病防制措施并未达到理想的效果，反而呈上升趋势。目前，国内外用于牛结核病的检测方法，大体上可分为三大类：第一类是细菌学检查法，如涂片镜检、细菌培养等；第二类是分子生物学方法，如核酸探针、PCR和DNA图谱方法。虽然这些方法具有一定的灵敏度和特异性，但均需在实验室进行，且对实验条件要求很高，还不能够用于基层的推广；第三类是免疫学方法，如皮内变态反应(PPD)、ELISA等方法。到目前为止，世界动物卫生组织(OIE)推荐的唯一的牛结核病的诊断方法就是牛结核变态反应(PPD)试验，该方法在牛结核病的诊断和防制过程中起到了重要作用，但是该方法还存在操作不方便、假阳性率高等弊端，除物理和化学的因素之外，更多的是非典型分支杆菌的干扰，常造成非特异性反应的发生，其敏感性和特异性不高。

与结核分枝杆菌的分泌蛋白一样，牛分支杆菌的分泌蛋白是一类具有较强免疫原性和反应原性的蛋白质分子，能在感染的机体内引起机体免疫反应，包括诱导机体产生抗体。按照免疫学基本原理，只要用分泌蛋白建立检测方法，检测到牛血清中相应抗体，就可以判定牛体内的分支杆菌感染状态。现用的ELISA方法都是采用单个的牛分支杆菌分泌蛋白作抗原，建立ELISA方法，直接检测牛血清中分支杆菌抗体，从而确定牛体内分支杆菌感染状态，但存在抗原识别位点较少，灵敏度不高的缺点。

经对现有技术的文献检索发现，尚未见与本发明的主题“牛血清中分支杆菌抗体的ELISA检测方法及抗原”有关的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种牛血清中分支杆菌抗体的ELISA检测方法及抗原。本发明的ELISA方法将牛分支杆菌两个特异性分泌蛋白混合包被，增加了血清中抗分支杆菌抗体的识别抗原位点，其灵敏度高于单个包被抗原；实验证明，本发明的ELISA方法重复性好、灵敏度高、特异性强。

本发明是通过以下的技术方案实现的，

本发明涉及一种牛血清中分支杆菌抗体的ELISA检测方法，包括如下步骤：

步骤一，取氨基酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的蛋白质作为抗原；

步骤二，采用常规ELISA方法检测牛血清，确定牛血清中有无分支杆菌抗体。

步骤二中，所述ELISA方法中，氨基酸序列如SEQ ID NO：1的蛋白质与氨基酸序列如SEQID NO：2所示的蛋白质的包被浓度的比值为1∶1。

步骤二中，所述ELISA方法中，氨基酸序列如SEQ ID NO：1以及氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示的蛋白质的包被浓度均为6μg/ml。

本发明还涉及一种抗原，所述抗原为两种蛋白质，所述蛋白的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示。

所述抗原，在牛血清中分支杆菌抗体的的ELISA检测方法中使用。

本发明中所涉及的大肠杆菌BL21(DE3)已在《刘芳，严懿嘉，朱建国，华修国，高谦。牛分枝杆菌Mb1761c蛋白的表达及其免疫原性初步研究[J]中国预防兽医学报。2008，30(11)：875～878》中公开；菌株(BL21(DE3))可通过公开市售的商业渠道取得，如上海天根生物公司，公司地址：上海市漕溪路258弄27号航星商务楼1号楼606室。