[发明专利]制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基及其发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基及其发酵方法。

背景技术

重组白细胞介素-1受体拮抗剂(简称IL-1ra)是一种存在于人体的蛋白质类细胞因子受体拮抗剂，通过结合白细胞介素-1(IL-1)受体，特异性地封闭IL-1的活性。

自Arend等1990年克隆出人IL-1ra的cDNA以来，各国学者都在对IL-1ra进行更为全面、深入的研究。同时，众多制药厂商也都在致力于IL-1ra的开发，2003年美国FDA批准Amgen公司生产的重组人IL-1ra(商品名Kineret)用于治疗类风湿性关节炎。我国SFDA 2008年批准西藏华西药业生产的重组人IL-1ra用于治疗眼部非感染性炎症，虽然也有厂家申请IL-1ra用于治疗类风湿性关节炎，但是至今未有产品正式上市销售。

目前制备重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的方法有真核表达和原核表达两种。真核表达产量低，成本高，但蛋白活性好。原核表达(大肠杆菌)表达分包涵体表达和可溶性表达。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基。

本发明所提供的发酵培养基，由以下成分组成：

胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、葡萄糖、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、维生素B₁、丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚和水；

以上成分在所述发酵培养基中浓度分别为：

胰蛋白胨32g/L、酵母粉20g/L、氯化钠0.5g/L、葡萄糖2g/L、十二水磷酸氢二钠15g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钙0.011g/L、硫酸镁0.96g/L、维生素B10.033g/L、丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚0.2ml/L。

本发明的另一个目的是提供制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的方法。

本发明所提供的制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的方法，包括以下步骤：将重组菌接种于所述发酵培养基，发酵培养，得到重组白细胞介素-1受体拮抗剂；

所述重组菌为向大肠杆菌中导入序列表中序列1所示基因，得到的重组大肠杆菌，所述序列中序列1所示基因通过如下重组表达载体导入大肠杆菌：将序列中序列1所示基因插入PET-30a载体的多克隆位点得到的重组表达载体。

所述方法中，在所述发酵培养前，包括如下种子培养的步骤：

(1)一级种子培养：将重组菌接种于种子培养基A，在PH值为7.2、37℃和200rpm的条件下培养12小时得到一级种子液；

所述种子培养基A由以下成分组成：

胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠和水；

以上成分在所述种子培养基A中浓度分别为：

胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L；

(2)二级种子培养：将步骤(1)得到的一级种子液按1％接种量接入种子培养基B，在PH值为7.2、37℃和200rpm的条件下培养7-8小时得到二级种子液；

所述种子培养基B由以下成分组成：

胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠和水；

以上成分在所述种子培养基B中浓度分别为：

胰蛋白胨16g/L、酵母粉10g/L和氯化钠5g/L。

所述发酵培养的温度为37℃；

所述接种量为9％-10％，具体为9％和10％；

所述发酵培养中，使发酵体系的溶氧量保持在30％-50％，具体为30％、40％和50％；

所述发酵体系的pH值为7.0-7.2，具体为7.0、7.1和7.2；

所述发酵体系为发酵容器内的所有物质。

所述发酵培养过程中，包括如下补料的步骤：在所述发酵体系的OD600达到7.0-9.0时，开始向发酵体系中补加补料培养基；

所述补加的补料培养基与所述发酵培养基的体积比为1∶3；

所述补料培养基由以下成分组成：

酵母粉、胰蛋白胨、甘油、葡萄糖、氯化铵、硫酸镁、维生素B₁和水；

以上成分在所述补料培养基中浓度分别为：

酵母粉200g/L、胰蛋白胨20g/L、甘油200ml/L、葡萄糖10g/L、氯化铵10g/L、硫酸镁5g/L、维生素B₁0.1g/L。