[发明专利]制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基及其发酵方法

权利要求书

1.一种用于制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基，由以下成分组成：胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、葡萄糖、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、维生素B₁、丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚和水；

以上成分在所述发酵培养基中浓度分别为：

胰蛋白胨32g/L、酵母粉20g/L、氯化钠0.5g/L、葡萄糖2g/L、十二水磷酸氢二钠15g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钙0.011g/L、硫酸镁0.96g/L、维生素B₁0.033g/L、丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚0.2ml/L。

2.制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的方法，包括以下步骤：将重组菌接种于权利要求1所述发酵培养基，发酵培养，得到重组白细胞介素-1受体拮抗剂；

所述重组菌为向大肠杆菌中导入序列表中序列1所示基因，得到的重组大肠杆菌，所述序列表中序列1所示基因通过如下重组表达载体导入大肠杆菌：将序列中序列1所示基因插入PET-30a载体的多克隆位点得到的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述发酵培养前，包括如下种子培养的步骤：

(1)一级种子培养：将重组菌接种于种子培养基A，在PH值为7.2、37℃和200rpm的条件下培养12小时得到一级种子液；

所述种子培养基A由以下成分组成：

胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠和水；

以上成分在所述种子培养基A中浓度分别为：

胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L和氯化钠10g/L；

(2)二级种子培养：将步骤(1)得到的一级种子液按1％接种量接入种子培养基B，在PH值为7.2、37℃和200rpm的条件下培养7-8小时得到二级种子液；

所述种子培养基B由以下成分组成：

胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠和水；

以上成分在所述种子培养基B中浓度分别为：

胰蛋白胨16g/L、酵母粉10g/L和氯化钠5g/L。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：

所述发酵培养的温度为37℃；

所述接种量为9％-10％，具体为9％和10％；

所述发酵培养中，使发酵体系的溶氧量保持在30％-50％，具体为30％、40％和50％；

所述发酵体系的pH值为7.0-7.2，具体为7.0、7.1和7.2；

所述发酵体系为发酵容器内的所有物质。

5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养过程中，包括如下补料的步骤：在所述发酵体系的OD₆₀₀值达到7.0-9.0时，开始向发酵体系中补加补料培养基；

所述补加的补料培养基与权利要求1所述发酵培养基的体积比为1∶3；

所述补料培养基由以下成分组成：

酵母粉、胰蛋白胨、甘油、葡萄糖、氯化铵、硫酸镁、维生素B₁和水；

以上成分在所述补料培养基中浓度分别为：

酵母粉200g/L、胰蛋白胨20g/L、甘油200ml/L、葡萄糖10g/L、氯化铵10g/L、硫酸镁5g/L和维生素B₁0.1g/L。

6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养中，包括如下诱导培养步骤：在发酵体系的OD₆₀₀值达到35-45时，向发酵体系中加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷进行诱导培养，使异丙基-β-D硫代半乳糖苷在发酵体系中的浓度为0.1mmol/L-0.2mmol/L，诱导培养的时间为3h-4h。

7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌菌株BL21(DE3)。