[发明专利]应用生物反应器工业化生产猪乙型脑炎疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及到兽用生物制品技术领域，具体涉及到一种应用生物反应器工业化生产猪乙型脑炎疫苗的方法。

背景技术

乙型脑炎(Jepanese Encephalitis，JE)，简称乙脑，是一种人蓄共患的蚊媒传播病毒性疾病，对猪引起猪的繁殖障碍。由于JEV通常在蚊-猪-蚊等动物间循环，猪被认为是JEV最重要的自然宿主，在给养猪业带来损失的同时，也是人类公共卫生潜在的威胁。目前使用疫苗预防接种仍然是预防该病的有效手段。

当前大规模应用的猪乙脑疫苗有鼠脑灭活疫苗，来自中山株或北京株病毒；细胞培养灭活疫苗，来自北京P-3株病毒；细胞培养减毒活疫苗，来自SA14-14-2株病毒。生产方法虽然相对简单，成熟，但生产劳动强度大，效率低，疫苗批间差异大，已经越来越不适应当前疫苗大规模生产的要求。

针对乙脑疫苗的生产方法，已有相关文献的报道。专利公开号为CN101732708A的专利申请，公开了一种利用地鼠肾原代细胞培养乙脑病毒的方法；专利公开号为CN1966075A的专利申请，公开了一种应用二倍体细胞株KMB17培养乙脑病毒的方法，专利公开号为CN1248471A的专利申请，公开一种利用Vero细胞制备乙脑疫苗的方法，其生产方法为转瓶或生物反应器培养，生物反应器培养微载体用量为2～7g/L，并且是采用批式培养。

以上文献均涉及到人用乙脑疫苗的制备方法，但生产过程手工操作密集，生产效率低，产品质量不稳定，而且猪乙脑疫苗的生产方法方面的文献却不见报道。

发明内容

本发明的目的为了克服猪乙脑疫苗现有生产方法的缺陷，提供一种应用生物反应器工业化生产猪乙型脑炎疫苗的方法，其优点是设备占地面积小、生产规模大；自动化控制程度高，生产效率好；培养设备密闭，不易污染；副产物少，疫苗的副反应小；生产的病毒液滴度高，疫苗质量稳定。

本发明的技术方案为：

应用生物反应器工业化生产猪乙型脑炎疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将微载体和生物反应器灭菌后，接种制苗用细胞，进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，接种乙型脑炎病毒，并继续培养，使病毒繁殖；所述的制苗用细胞为对猪乙型脑炎病毒毒株敏感的细胞，且为Vero细胞和BHK-21细胞；(2)、待细胞病变达到80％以上时，停止培养，收获病毒液；(3)对收获的病毒液进行超滤浓缩和病毒灭活；(4)通过柱层析方法纯化灭活的病毒制成疫苗。

所述的病毒的接种量为0.0001～0.1MOI。

所述的生物反应器设定参数为：pH 6.5～7.8、温度33～37℃、溶氧30～80％、搅拌速度30～100rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH 6.8～7.2、细胞培养阶段温度设定37℃，病毒培养阶段温度设定35℃、溶氧50％、搅拌速度30～100rpm。

所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2～25g/L。

所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。

所述的生物反应器容积为14～150L；制苗用细胞可采用14L～40L或14L～40L～150L逐级放大的培养模式，即通过胰酶将14L生物反应器培养的细胞消化下来，作为种子细胞接种到40L生物反应器，再将40L反应器内培养的细胞消化下来作为种子细胞接种到150L生物反应器，如此形成生物反应器之间的逐级放大培养过程，从而避免了单纯的用转瓶培养种子细胞而容易造成污染和增加劳动强度的缺陷；于40L或150L生物反应器培养狂犬病毒；或，直接用14L、40L或150L的生物反应器培养病毒。

所述生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的速率根据细胞的密度以每天0.5～4个工作体积。

本发明采用生物反应器微载体培养技术进行细胞的高密度培养，生产猪乙型脑炎疫苗，与传统的转瓶生产工艺相比，自动化控制程度高，生产可实时监控；节省人力，降低成本；生产用地少，规模易于扩大；生产的病毒滴度高，批间差异小，产品质量稳定，副反应小。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

图2a为细胞接种后4天的微载体细胞图片。

图2b为接毒后细胞状态的微载体细胞图片。

图3为细胞生长曲线。

具体实施方式

以下是本发明一个具体的实施方案，以进一步的阐述本发明，但不能解释为限制本发明的范围。

实施例1

生物反应器：美国NBS公司14L和40L生物反应器；

微载体：Cytodex-1(通用电气医疗集团生命科学部)；