[发明专利]木聚糖酶基因及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种新的酸性木聚糖酶及编码该酶的基因，本发明还涉及包含该基因的重组载体和所述基因的应用。

背景技术：

木聚糖是半纤维素的重要组分，它是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一。广泛存在于在农业副产物如玉米芯、麦麸、米糠、秸秆、甘蔗渣等中，但这一重要的可再生资源一直难以得到有效的利用。

木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一类酶的总称。近年来，从极端微生物中分离木聚糖酶引起了人们的极大的兴趣。这些木聚糖酶由于适应极端环境而获得了特殊的性质，可以满足工业应用的特殊需求。如来源于Thermotoga sp.嗜热木聚糖酶(Simpsonet al.Biochem，1.277：413-417.1991)；来源于嗜碱菌Bacillus sp.strain 41M-1嗜碱木聚糖(Nakamura et al.，Appl Environ Microbiol.59：2311-2316.1998)；来源于Penicillium sp.40嗜酸性木聚糖酶(Kimura et al.Biosci Biotechnol Biochem.64：1230-1237.2000)等。

以往对碱性木聚糖酶(酶的最适作用pH值在6-7)的研究较多，但有关酸性木聚糖酶(pH4.0以下时仍然保持较高酶活性)的报道比较少。由于酸性木聚糖酶可以广泛应用于能源工业、酿酒工业、饲料工业、食品工业等众多领域，充分显示出它在生产上的巨大潜力。因此，研发酸性木聚糖酶具有重要实用价值。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、酿酒以及能源工业中应用的新的酸性木聚糖酶。

本发明所要解决的技术问题如下：

提供一种新型的酸性木聚糖酶基因，公众得知该基因序列就可以获得一种新型的酸性木聚糖酶木聚糖酶；

提供包含上述木聚糖酶及其基因的重组载体；

提供包含上述木聚糖酶基因的重组菌株；

提供一种制备酸性木聚糖酶的方法；

提供所得上述酸性木聚糖酶的应用。

本发明人从天然菌株桔青霉Penicillium citrinum CR-2中发现了一种酸性木聚糖酶，命名为XYL，该酶基因编码327个氨基酸，其序列如SEQ ID NO.1所示。编码酸性木聚糖酶XYL SEQ ID NO.1的基因xyl序列如SEQ ID NO.4所示。

其中，N端19个氨基酸为其预测的信号肽序列“MVQIKTAALA ALFAGQVLS”。因此，成熟的酸性木聚糖酶XYL有308个氨基酸，其理论分子量为34.2kDa，序列如SEQ IDNO.2所示，编码SEQ ID NO.2的基因序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明通过PCR的方法分离克隆了这一木聚糖酶基因xyl，DNA全序列分析结果表明，木聚糖酶XYL结构基因xyl全长1520bp，含有9个内含子，序列如SEQ ID NO.3所示，cDNA长984bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.4所示。

其中，信号肽的碱基序列为：ATGGTTCAAA TCAAGACAGC TGCGCTGGCC GCTCTTTTCGCAGGCCAAGT GCTTTCC。

本发明将木聚糖酶基因xyl插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接，得到包含木聚糖酶基因xyl的重组载体。所述表达载体优选为质粒pPIC9K，得到重组载体pPIC9K-xyl。

作为本发明的一个最优选的实施方案，所述表达载体合适的限制性酶切位点之间是质粒pPIC9K上的SnaB I和AvrII限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9K-xyl。

本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/xyl。

本发明还提供了一种制备酸性木聚糖酶的方法，包括以下步骤：

1)用权利要求重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶的表达。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，更优选的，是将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/xyl。

重组木聚糖酶XYL的性质测定