[发明专利]一种棉花EPSP合成酶突变体基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程研究领域，具体涉及棉花EPSP合成酶基因的改造及表达载体的构建，以及在抗草甘膦转基因植物品种研制中的应用。

背景技术

草甘膦是一种非选择性除草剂，具有广谱除草和土壤中迅速降解的优点，而且由于动物体内不存在这种酶，是对人、畜最安全的除草剂之一。草甘膦理化性质稳定、高效、广谱、低毒、低残留、易于被微生物分解，不破坏土壤环境等优点，已广泛应用于农业生产中，成为目前世界上生产量最大的农药品种。自从1976年美国孟山都公司的草甘膦类除草剂-农达(Roundup)研制成功并得到广泛应用以来，作物抗草甘膦转基因研究成为抗除草剂基因工程研究的热点。随着抗草甘膦基因克隆的发展，抗草甘膦转基因作物也相继问世并大面积推广应用。

草甘膦的作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。该酶是真菌、细菌、藻类和高等植物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中一个关键性的酶。草甘膦是磷酸稀醇式丙酮酸(PEP)的类似物，是EPSPS竞争性抑制剂，草甘膦、EPSPS和三磷酸莽草酸(S3P)结合形成EPSPS-S3P-草甘膦复合体(此复合体非常稳定)，抑制EPSPS的活性导致分支酸合成受阻，阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，最终导致一些激素和关键性代谢物如类黄酮、木质素和酚类化合物代谢失调，从而扰乱了生物体正常的氮代谢而使其死亡。

目前植物抗草甘膦转基因工程研究有四种方法：1)选用对草甘膦不敏感的EPSPS或通过氨基酸序列改变获得抗性EPSPS基因；2)将编码EPSPS在植物体中过量表达；3)导入降解草甘膦的基因(如编码草甘膦氧化还原酶的gox基因)；4)导入氮乙酰转移酶(GAT基因)使草甘磷乙酰化等(Barry et al.，1992；Padgette et al.，1996；Dill，2005；Tan et al.，2006；Castle et al.，2004)。其中商业化使用最广泛的是在植物中过量表达对草甘膦不敏感或突变的EPSPS基因。

选用抗性EPSPS基因是获得转基因作物的关键因子。改变EPSPS功能区的氨基酸序列，降低其与草甘膦的亲和力，同时保持酶的催化活性。Stalker DM等(1985)应用化学诱变剂处理鼠伤寒沙门氏菌，从草甘膦抗性突变系中克隆了aroA基因的突变体，经DNA和蛋白质序列分析证实突变体中第101位的Ser取代了野生型中的Pro，将此突变体基因转入大肠杆菌中，获得了抗草甘膦特性；Sost D等(1990)克隆并测序了来自野生型Klebsiella pneumoniae和具有草甘膦抗性的突变型Klebsiella pneumoniae K1(它编码一个对草甘膦不敏感的EPSPS)的aroA基因，显示一个单碱基的不同导致在氨基酸序列中96位Gly变为Ala。Baerson SR等在马来群岛发现了一种具有草甘膦抗性的牛筋草(Eleusine indica)，该牛筋草比该地其它草甘膦敏感物种的LD50值要高出2-4倍，通过比较抗性牛筋草和感性牛筋草的EPSPS序列，发现有两个氨基酸不同，其中一个为有意突变，即抗性牛筋草EPSPS的第106的Pro被Ser替代。我国的向文胜等(2001)，筛选出的抗草甘膦菜豆与感性菜豆比较，抗性菜豆的513位为Gln，感性菜豆该位点为Glu。何鸣等(2002)获得抗性提高的鼠伤寒沙门氏杆菌和大肠杆菌的EPSPS基因，两个突变体在42位Met替换Thr。Monsanto公司将来自矮牵牛、番茄、拟南芥、大豆、玉米、鼠伤寒沙门氏菌的EPSPS基因的第80-120中的Gly替换为Ala，第170-210中的Ala替换为Thr，获得抗草甘膦的大豆、玉米、油菜等。

植物中过量表达EPSPS基因可显著增强植株抗草甘膦的功能。Amrhein等对通过逐渐增加草甘膦的选择压筛选到一个耐草甘膦矮牵牛细胞系，分析该细胞系EPSPS基因结果发现，目的基因拷贝数增加了20倍左右。利用35S启动子启动该基因在转基因植株中大量表达，转基因植株对草甘膦施用量的耐受程度为杀死非转基因植株用量的4倍以上。Todd A等对大量使用草甘膦农田中的长芒苋研究发现，抗草甘膦植株中EPSPS酶活与敏感型一致，但基因拷贝数比敏感型增加了5～160倍，进一步分析发现，其抗性高低与蛋白表达量及基因拷贝数成正相关。