[发明专利]小鼠精原干细胞的体外分离培养方法及其专用培养基

说明书

技术领域

本发明涉及小鼠精原干细胞的体外分离培养方法及其专用培养基。

背景技术

精原干细胞是部分未分化的A型精原细胞，位于雄性哺乳动物睾丸曲细精管生精上皮基膜内，在复杂而高度有序的精子发生过程中占据极其重要的地位。精原干细胞是一种可以将基因传递给后代的干细胞，在雄性生物中精原干细胞正常的自我更新和增殖、分化保证了终生的生殖细胞供应。精原干细胞维持一定的数目以及保持正常的增殖、分化功能是确保男性生育的关键。在合适的环境和条件下，精原干细胞能够分化为其他组织的细胞。

精原干细胞的研究与应用需要获得长期培养并维持其体内分化能力的稳定细胞系，这些稳定细胞系的培养大都来自于幼年小鼠的睾丸组织，孙源等在《小鼠精原干细胞体外培养体系的建立[J].中华男科学杂志，2008，14(8)：695～700》中披露了以下内容：取出生后2～6d的雄性ICR小鼠30只，脱颈法处死，切取睾丸后，采用两步酶消化法制成单细胞悬液，添加特定培养液，以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞进行体外培养。对培养细胞进行鉴定，结果：小鼠精原干细胞在体外稳定增殖，所得克隆AP强阳性，标记物检测GFRα-1+/Oct-4+/VASA+/SCP3-，基因表达GFRα-1+/Oct-4+/SCP3-，证实所培养细胞为处于未分化状态的小鼠精原干细胞。在本研究建立的培养体系下小鼠精原干细胞可稳定传代并保持未分化状态，为探索体外精子发生过程提供了良好的研究平台。《自然》杂志在2006年第440卷第7088期第1199～1203页刊登了《Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis》(成年小鼠精原干细胞的多潜能性)一文，文中提及，成年个体精原干细胞可发育成各种组织。

经对现有技术的文献检索发现，《突变研究》(Mutat.Res.)杂志在1993年第290期193～200页刊登了一篇名为《A quantitative study of spermatogonial multiplication and stem cell renewal in the C3H/101 F1 hybrid mouse》(C3H/101 F1杂交鼠中精原干细胞自我更新的定量研究)的文章，文中提及，在幼年个体中，大约每1万个睾丸细胞中才有2～3个精原干细胞，仅占睾丸所有生精上皮细胞总数的0.02％～0.03％，而成年睾丸中精原干细胞所占的比例更低，分化程度更高，因而长期培养的难度更大。用成年小鼠精原干细胞建立细胞系并产生后代小鼠，在国内外均未见相关报道。因此，本发明要解决的技术问题是：如何在体外培养成年小鼠精原干细胞。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种小鼠精原干细胞的体外分离培养方法。利用本发明的方法，可使得来源于幼体或成体小鼠的精原干细胞均能够在体外长期培养并增殖，能够建立长期维持稳定生长的精原干细胞系，并且维持其精子发生的功能。

一种小鼠精原干细胞的体外分离培养方法，包括如下步骤：

步骤一，收集小鼠睾丸，采用两步酶消化法制备细胞悬液；

步骤二，利用免疫磁珠分选法分离出精原干细胞；

步骤三，制备精原干细胞的培养液，对精原干细胞进行原代培养和传代培养。

步骤一中，所述免疫磁珠分选法使用的磁珠为Thy1磁珠。

步骤一中，所述Thy1磁珠为CD90。

步骤三中，所述原代培养和传代培养时加入STO细胞饲养层，所述STO细胞饲养层的制备方法具体为：向STO细胞中加入含10μl/ml丝裂霉素C的STO细胞培养液，之后于培养箱培养；PBS缓冲液洗涤；加入0.25％胰蛋白酶，置于培养箱中消化4-5min；加入STO细胞培养液终止胰蛋白酶消化，并用移液枪吹打，使细胞分散均匀；转移细胞悬液至离心管中，离心，弃去上清液，向离心管中加入STO细胞培养液，用移液枪吹匀细胞，然后分至铺有明胶的平皿中，加入STO细胞培养液，用移液枪将培养液均匀分散处理的细胞，培养24h后，得到的STO细胞即可作为精原干细胞的饲养层。

所述STO细胞培养液配方：88％DMEM，10％FBS，0.3mg/ml L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素。

步骤三中，所述传代培养具体为4-7天传代1次。