[发明专利]利用单抗检测莱克多巴胺残留的间接化学发光酶联免疫试剂盒

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种酶联免疫试剂盒，尤其涉及一种莱克多巴胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒。

【背景技术】

莱克多巴胺(Ractopamine，RAC)是一种苯乙醇胺类β₂-肾上腺素受体激动剂，可选择性激动平滑肌的β₂受体，临床上主要用于治疗支气管哮喘，充血性心力衰减症和肌肉萎缩症等，莱克多巴胺的结构式如下：

有研究表明，动物日粮中莱克多巴胺的添加量为临床治疗量的5-10倍时，动物体内的营养成分由脂肪向肌肉转移，表现出营养再分配效应，进而调控动物体营养代谢路径，增强脂肪分解代谢，促进蛋白质合成，显著增加胴体瘦肉率，提高饲料报酬率，对猪的效应尤为明显。

由于莱克多巴胺在动物脏器中残留，并通过食物链进入人体，人体累计摄入超过一定值或食用了高残留的内脏组织，易出现副作用。表现为骨骼肌收缩增加，破坏快缩肌纤维与慢缩肌纤维间的融合，引发肌肉震颤，四肢和面部肌肉尤为明显等症状。其他中毒症状包括心动过速、心率失常、腹痛、肌肉疼痛、恶心和眩晕等。除美国FDA外，世界各国均禁止将莱克多巴胺用于生猪生产，尤其近年来，随着我国政府对非法使用克伦特罗打击力度的加大，莱克多巴胺的非法使用日趋严重。

莱克多巴胺残留传统的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)，微生物法，气/质联用分析法(GC-MS)，液/质联用分析法(LC-MS)等。虽然这些方法测定结果很精确，但由于存在需要昂贵的仪器设备、熟练的专业人员、烦琐费时、周期长、费用高、不能现场操作等缺陷，不能满足实际检测工作的需求。ELISA酶联免疫技术具有敏感、特异、快速、简便的特点，近年来已被应用于莱克多巴胺残留检测，Haasnootet等建立了阻断ELISA方法，Shelver等建立了间接竞争ELISA方法，国内于洪侠等对莱克多巴胺多克隆抗体、曲勍等对莱克多巴胺单克隆抗体进行了研究，但有关化学发光酶联免疫(CL-ELISA)检测方法的建立尚未见报道。

【发明内容】

本发明的目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种利用单抗检测莱克多巴胺残留的间接化学发光酶联免疫试剂盒。该试剂盒具有检测灵敏度高、应用灵活、方便的特点。

本发明提供的利用单抗检测莱克多巴胺残留的间接化学发光酶联免疫试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和试剂；该试剂盒由下列试剂组成：

A、各孔包被有包被抗原即莱克多巴胺与载体蛋白的偶联物的酶标板1块；

B、莱克多巴胺标准溶液：浓度分别为0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL各一瓶；

C、酶标羊抗鼠抗体溶液：辣根过氧化酶-羊抗鼠IgG原液，使用时用洗涤溶液配制成1∶2000的工作浓度；

D、莱克多巴胺抗体溶液：人工免疫抗原免疫动物制得的单克隆抗体，使用时用洗涤溶液稀释成1∶8000的工作浓度；

E、发光溶液：0.01M鲁米诺、pH＝8.8的0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液和体积比3/10000的H₂O₂的混合液；

F、洗涤溶液：指含有吐温-20体积分数0.05％的pH＝7.5、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液；

G、包被溶液：1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L水中，调节pH为9.5；

H、封闭溶液：由10g OVA溶于1L洗涤溶液中，再加入质量比为0.05％的NaN₃配制而成。

上述检测莱克多巴胺残留的酶联免疫试剂盒中：

所述偶联物的载体蛋白为分子量范围是6.7KDa～6.8KDa的牛血清蛋白。

包被酶标板的包被抗原是采用水溶性碳化亚二胺法(EDC)由莱克多巴胺与牛血清蛋白偶合制成，纯化后的抗原浓度为15mg/ml，优选包被浓度为稀释1∶2000。制备抗体的人工免疫原同样由莱克多巴胺与牛血清蛋白偶合制成。

所述酶标羊抗鼠抗体为辣根过氧化酶-羊抗鼠IgG原液，其稀释倍数优选为1∶2000。

所述莱克多巴胺抗体是由莱克多巴胺与分子量范围是6.7KDa～6.8KDa的牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫动物制得的单克隆抗体，其浓度为5.9ng/ml.其工作浓度优选为稀释1∶8000。

本发明中包被莱克多巴胺抗原的酶标板的制备步骤：