[发明专利]一种体外培养人体黏膜活组织模型及其建立方法和应用

权利要求书

1.一种体外培养人体黏膜活组织模型，其特征在于，通过病毒感染离体后体外培养的粘膜组织，模拟病毒粘膜感染的生物学轨迹，建立体外培养人体黏膜活组织模型。

2.按权利要求1所述的体外培养人体黏膜活组织模型，其特征在于，所述的离体粘膜组织包括但不限于涉及HIV性传播途径的生殖道/器或消化道组织粘膜。

3.按权利要求1或2所述的体外培养人体黏膜活组织模型，其特征在于，所述的离体粘膜组织是离体肠道粘膜。

4.按权利要求1所述的体外培养人体黏膜活组织模型，其特征在于，所述的病毒包括但不限于HIV的单一感染周期的假病毒、感染性克隆、实验室株、临床分离株或其他种类病毒。

5.权利要求1的体外培养人体黏膜活组织模型的建立方法，其特征在于，其包括步骤：

1)对离体组织样本预处理

离体后组织块，浸入器官移植保护液，1-2小时内用含高剂量抗生素的DMEM培养基冲击并清除组织块中附着的细菌、真菌污染物，保证无污染发生；

2)组织培养：

采用Transwell小室培养，或海绵筏支撑培养，或浸入培养方式，37℃，5％ CO2培养培养上述预处理的组织块；

3)观察组织形态变化

取培养后不同天数的组织块，经甲醛固定，石蜡包埋，通过苏木精一伊红(HE)染色法，在显微镜下观察组织结构。

4)噻唑蓝法检测组织存活力.

取培养不同天数的组织块分别置48孔板中，加入含0.5mg/ml MTT的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养3小时，弃上清，PBS冲洗组织块，加溶解液过夜浸泡，溶出甲瓒，570nm波长处测定吸光度值，，计算组织活力百分数；

5)病毒感染粘膜组织

采用HIV-1病毒株与假病毒株，接种于粘膜培养孔，37℃，5％CO2孵育过夜，次日用PBS清洗粘膜组织，去除游离病毒，换培养基培养，实验结束时收集组织进行P24核酸检测；HIV病毒株实验中定期收集培养上清，ELISA法检测p24含量。

6.权利要求1的体外培养人体黏膜活组织模型在制备HIV粘膜感染机制研究、待测药物临床前安全性与有效性评价或粘膜局部免疫学研究平台中的用途。

7.按权利要求6所述的用途，其特征在于所述的待测药物包括但不局限于化学合成药物、生物药物或微生物杀菌剂与粘膜疫苗。

8.按权利要求6所述的用途，其特征在于所述的待测药物临床前安全性包括但不限于药物对直接施用部位粘膜以及非直接施用部位的毒性、对粘膜免疫系统的激活与致病作用、以及粘膜被致病原感染的敏感性增加作用。