[发明专利]一种新型组织特异性小环载体hIFNγ基因治疗药物

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地说是涉及一种由EB病毒特异性启动子oriP启动的人IFNγ基因与非病毒类小环载体构建而成的重组体，靶向性抑制鼻咽癌生长的作用研究。

背景技术

基因治疗是一种新的治疗手段，可用于多种疾病的治疗，包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病等。随着分子生物学技术的进步，肿瘤基因治疗在实验研究和临床试验中的应用都有了很大的进展。在基因治疗过程中，基因导入系统是最关键的技术。目前，在基因导入载体方面主要分为两大类，即病毒载体系统及非病毒载体系统。国内已经应用于临床的“今又生”便是一种由腺病毒载体携带p53抑癌基因治疗多种肿瘤的基因治疗试剂。虽然病毒载体作为基因传递的工具被广泛地采纳，但仍存在着局限性，可诱导机体产生某种程度的免疫反应，引起插入突变等致瘤及致毒的风险，且载体容量有限，制备滴度不高等。曾经报道的一例死于基因治疗的病例便是因腺病毒载体引起的全身炎症反应导致。因此，需要寻求一种更为安全的基因载体，而非病毒基因载体以其设计灵活、低毒性、低免疫原性、低致瘤性、易制备及可以实现细胞特异性和长期基因表达的优点，为基因治疗开辟出一条新的道路。

小环DNA(minicircle DNA)载体是一种自1997年发展起来的新型非病毒基因载体，与传统的质粒载体相比，小环DNA载体仅含有外源基因的表达盒，不包括来自细菌质粒的骨架结构。因为该载体所携带的外源基因的表达盒以环状超螺旋的形式存在，所以被称为小环DNA。小环DNA是由相应的母体质粒(parent plasmid)在宿主菌内以体内重组的方式产生的。小环DNA的母体质粒的基本结构与常规质粒相同，含有外源基因的表达盒及原核骨架(原核复制起点、抗性基因筛选标记等)，此外，该质粒上还携带有一个重组酶的表达盒。重组酶可在宿主菌内被诱导表达，将母体质粒重组成为两个环状DNA，分别是携带外源基因表达盒的小环DNA和环状骨架(原核复制起点、抗性基因筛选标记、重组酶的表达盒等)。小环DNA在宿主菌内重组产生后，可通过相应的纯化方法与环状骨架分离，去除环状骨架的污染。

目前，已构建成功的小环DNA载体系统根据所选用的重组酶的种类不同，可分为3种。它们所采用的整合酶分别是λ噬菌体来源的重组酶、P1噬菌体来源的cre重组酶和链霉菌温和噬菌体来源的φC31整合酶。美国斯坦福大学的Chen Zhiying等在2003年构建的小环载体系统采用源于链霉菌温和噬菌体的φC31整合酶，这种重组酶所介导的重组过程为单向反应，小环DNA的产率可达97％。这一系统最大的特点在于毋需复杂的纯化过程，可由宿主菌内直接提取小环DNA。该系统的母体质粒上携带有内切酶I-SceI的表达盒，当φC31整合酶在宿主菌内完成重组过程后，I-SceI可将环状骨架及少量未重组的母体质粒消化成为线性DNA，这些线性DNA随后被胞内的外切酶降解。因此，采用这一系统可直接由宿主菌内提取小环DNA，毋需进一步纯化，有利于小环DNA的大规模制备。本发明所采用的就是此种小环DNA系统。

研究表明，在超过90％的鼻咽癌组织中可以检测到EB病毒感染，而在癌旁正常组织中则检测不到EB病毒的存在。鼻咽癌属于EB病毒II型潜伏型感染，在携带EB病毒的细胞中恒定表达EB病毒核抗原1(EBNA1)蛋白。EBNA1可以使EB病毒的基因组以稳定的附加体形式存在，并参与病毒基因组的复制、核转移，介导EB病毒对宿主的免疫逃逸。在EB病毒基因组中存在3个EBNA1结合位点，其中亲和力最高的是位于oriP序列中的FR区。FR区由20个串联重复的30bp序列组成，是依赖于EBNA1的转录增强子。Li Jianhua等在2002年构建了带有FR序列的CMV启动子(oriP-CMV promoter)，在鼻咽癌组织中特异表达p53基因，这是首次针对EB病毒阳性的鼻咽癌组织构建特异表达外源基因的基因治疗载体。如果把这种启动子用于改造小环载体，将有望获得在EB病毒阳性的鼻咽癌组织中高效、持续表达外源基因的靶向性小环载体。

发明内容

Wu Jiangxue等在2006年首次将小环载体应用于抗肿瘤基因治疗，构建携带人IFNγ的重组小环DNA载体mc-IFNγ，采用瘤内注射的方式治疗鼻咽癌移植瘤荷瘤小鼠，证明小环载体可在肿瘤组织内介导外源基因高效、持续表达，较传统质粒更有效的抑制鼻咽癌移植瘤的生长。

在此基础上，本发明将对小环载体进行改进，构建在EB病毒阳性鼻咽癌组织中靶向表达的小环载体，研究靶向小环载体对鼻咽癌的抑制作用，为鼻咽癌等EB病毒阳性的肿瘤的治疗提供新的候选药物。