[发明专利]一种培育克隆动物或转基因克隆动物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种培育克隆动物与转基因动物的方法。

背景技术

哺乳动物体细胞克隆包括卵母细胞的成熟培养、供体细胞培养、核移植操作、细胞融合、胚胎培养等步骤。在常规体细胞克隆时，受体卵母细胞是从卵巢表面抽得的卵丘卵母细胞，经体外成熟培养20-22hr(牛、羊等)、40-44hr(猪)后，脱除卵丘细胞。然后再选择排出第一极体的卵，将其核物质去除后，作为受体胞质。这样处理得到的卵母细胞，其第一极体很容易偏离卵的遗传物质，在以PB1为标志的盲吸去核过程中，去核率降低。如果使用荧光染料并辅以紫外线照射法，易造成对卵的伤害，影响胚胎质量。

选择形态良好的体细胞注入去核卵母细胞的卵周隙中，经过电脉冲刺激使体细胞融入卵中，形成重构胚。在这期间，融合胚不经任何处理，只是移到胚胎培养液中培养。然后，重构胚再经化学处理使其激活。激活方法是钙离子激活剂结合蛋白合成抑制剂处理。把经过激活处理的胚胎转入胚胎培养液进行培养。

常规克隆操作的不足在于，重构胚的染色体容易发生位置漂移、扩散现象，造成胚胎非正常二倍体率增加，形成多个微核，影响胚胎发育与胚胎质量。最终影响克隆效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种培育克隆动物胚胎或转基因克隆动物胚胎的方法。

本发明提供的上述方法包括如下步骤：

1)获得离体的去核卵母细胞，2)将离体的供体细胞与所述去核卵母细胞融合得到重构胚，3)将所述重构胚进行体外激活，4)将激活的重构胚进行培养，其特征在于：步骤3)中，所述体外激活包括将所述重构胚用钙离子激活剂进行2次以上的处理，然后将处理过的重构胚在蛋白合成抑制剂或蛋白质磷酸化抑制剂中激活，得到激活的重构胚，将所述激活的重构胚培养得到所述克隆动物胚胎或转基因克隆动物胚胎。

在一实施例中，上述处理的次数为2次；所述处理包括如下步骤：

a)将所述重构胚放置在所述钙离子激活剂中5分钟；再将所述重构胚转入胚胎培养液中培养10-15分钟；

b)在步骤a)的基础上，将所述重构胚放置在所述钙离子激活剂中5分钟。

在另一实施例中，上述处理的次数为3次；所述处理包括如下步骤：

a)将所述重构胚放置在所述钙离子激活剂中5分钟；再将所述重构胚转入胚胎培养液中培养10-15分钟；

b)在步骤a)的基础上，将所述重构胚放置在所述钙离子激活剂中5分钟；再将所述重构胚转入胚胎培养液中培养10分钟；

c)在步骤b)的基础上，将所述重构胚放置在所述钙离子激活剂中2分钟。

所述胚胎培养液是在CR1aa培养液或SOFaa培养液中添加BSA得到的培养液；所述BSA在所述胚胎培养液的终浓度是0.4g/100ml；所述培养条件是38.5℃和5％CO₂；所述CR1aa培养液和SOFaa培养液的溶剂均为水，溶质分别如表1和表2所示。

表1.CR1aa培养液的溶质