[发明专利]靶向ZNF268基因的RNA干扰表达载体构建及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及针对ZNF268基因的小干扰RNA及其表达载体构建及应用。 

背景技术

ZNF268基因是2001年被发现的一种典型的KRAB/C2H2型锌指蛋白类基因。众多相关的研究结果表明：1)ZNF268基因在生物体的分化发育过程中，甚至是许多疾病(包括白血病、肿瘤、炎症等)的发生发展过程中均发挥着关键的作用；2)由于ZNF268基因存在着可变剪接现象，并且其剪接异构体在白血病人血细胞中有特异性的表达方式，因此ZNF268基因剪接异构体可以在制备治疗或预防白血病的药物中得到应用，可以快速、准确判断是否有白血病的发生(CN101422617A；Zhao ZZ，et al.Oncol.Rep.2008，20，1243-8)。 

为了更好地解析ZNF268基因的生物学功能和挖掘其在临床上潜在的应用价值，进一步阐明ZNF268基因的生物学功能成为必要。目前，运用RNA干扰的方法研究基因功能成为了基因功能研究中最重要的手段之一，但是针对ZNF268基因干扰的研究尚未见任何报导。 

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的一种生物学现象。RNAi的作用提供了一种经济、快捷、高效的抑制特异基因表达的技术手段，有助于研究该基因在生物模型系统中的作用，是研究基因功能的重要工具，并且逐步成为病毒性疾病、遗传性疾病以及肿瘤等的基因治疗研究的一种手段。RNAi是在研究秀丽新小杆线虫(C.elegans)反义RNA(antisense RNA)的过程中发现的，由dsRNA介导的同源RNA降解过程。1998年华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和 马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello首次将双链dsRNA注入线虫，结果诱发了比正义链和反义链的单独注射都要强的基因沉默，他们将这种由dsRNA引发的特定基因表达受抑制现象称为RNA干扰。此后dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中。 

RNA干扰是通过一类较稳定的中间介质实现的。长度为21-23nt的小RNA分子是引起RNA干扰现象的直接原因。这种小RNA分子被称之为小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。基于对RNA干扰机制的认识，人们发展了多种RNAi技术。这些技术的核心思路就是通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(正义RNA链和反义RNA链)，从而诱导内源靶基因的降解，达到阻止基因表达的目的。siRNA目标位点的筛选是实现RNAi作用的关键，一般有以下几个原则：1)在预定沉默的mRNA中找一段21nt的序列，起始是AA；2)找2-4个小片段的RNA，通过SECs(siRNA expression cassettes，SECs)筛选最有效的siRNA；3)在19nt的RNA片断中不能含有连续4个T或A的区域；4)通过在线数据库BLAST序列比对，确定所选择片断的序列特异性；5)序列中GC％含量应该在30-50％之间(详见文献：Sui et al.PNAS，2002，99，5515-20)。而目前获得siRNA产物的方法主要包括以下五种：1)化学合成；2)体外转录；3)RNase III降解dsRNA；4)siRNA表达载体；5)PCR表达框。在以上方法中，化学合成、体外转录和RNase III降解dsRNA均是在体外制备得到siRNA，siRNA需要进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此将其高效地转入细胞也是研究成功与否的关键步骤；而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则是转染到细胞的DNA模板经过体内转录得到siRNA，siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模板，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，但是主要缺点在于PCR产物很难转 染到细胞中，也不适于大规模制备。比之siNRA表达框架，siRNA表达载体可以在克隆菌株中大量扩增，便于大规模制备，并且可以使用常规的质粒DNA转染方法，将siRNA表达载体转入细胞里，在细胞内加工生成siRNA。相比其它四种方法，siRNA表达载体是唯一可以进行长期研究的方法，因为该方法中克隆到的带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续表达，进而抑制靶基因的表达，持续时间可达数周甚至更久。