[发明专利]人心肌肌钙蛋白T/人心肌肌钙蛋白I融合蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和蛋白质工程领域，利用基因工程技术生产人心肌肌钙蛋白T-人心肌肌钙蛋白I双功能融合蛋白。

背景技术

肌钙蛋白是肌肉收缩的调节蛋白，包括三种亚型：骨骼股快肌型、骨骼股慢肌型和心肌型，由三个亚基组成：肌钙蛋白C(Troponin C，TnC)、肌钙蛋白T(Troponin T，TnT)和肌钙蛋白I(Troponin I，TnI)。肌钙蛋白C在骨骼肌和心肌中是相同的，但心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)和心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)是心肌特有的，与两种骨骼肌亚型的氨基酸序列不同。cTnT和cTnI以两种形式存在：游离形式存在于胞浆中，结合形式存在于心肌肌纤维上。在心肌细胞膜完整状态下，cTnT和cTnI不能透过细胞膜进入血循环，故健康人血内不含或含极低量的cTnT和cTnI。心脏损伤早期，心肌细胞未坏死，但细胞膜破坏，游离形式的cTnT和cTnI进入组织间隙，经淋巴回流入血。急性心肌梗死患者发生不可逆性心肌缺血，心肌细胞坏死，肌纤维降解，可导致结合池cTnT和cTnI释放，血中cTnT和cTnI可显著升高，并维持很长时间。

cTnT和cTnI具有心肌特异性，是目前最好的特异性标志物，现已取代CK-MB成为心肌损伤的诊断“金标准”。本研究利用基因工程技术生产人心肌肌钙蛋白T-人心肌肌钙蛋白I融合蛋白，作为检测cTnI、cTnT的通用参考标准品。

发明内容

本发明要解决的技术问题：研制时间分辨荧光免疫分析(time-resloved immunofluorometricassay，TRFIA)检测cTnT和cTnI试剂盒的参考标准品。

本发明解决上述技术问题的技术方案是：

利用基因工程技术生产人心肌肌钙蛋白T-人心肌肌钙蛋白I融合蛋白。

本发明融合蛋白通过将人心肌肌钙蛋白T和人心肌肌钙蛋白I通过基因重组、转化构建工程菌表达获得，其中基因重组和转化的方法均为本领域普通技术人员所熟识的技术。人心肌肌钙蛋白T和人心肌肌钙蛋白I通过Leu-Asp进行连接。为了便于融合蛋白的分离纯化，本发明所述的融合蛋白的C端连接有组氨酸标签。

本发明还提供一种编码本发明融合蛋白的多核苷酸，该多核苷酸由人心肌肌钙蛋白TcDNA、人心肌肌钙蛋白I cDNA通过CTCGAC连接而成；该多核苷酸人心肌肌钙蛋白I cDNA的末端还可以连接有CAC CAC CAC CAC CAC CAC。

将所述的编码本发明融合蛋白的多核苷酸通过基因重组插入到原核表达载体中，然后转化大肠杆菌可获得高效表达本发明融合蛋白的工程菌；所述的原核表达载体可以是pET24a或pET24b，大肠杆菌为Rosetta。

本发明融合蛋白在上述工程菌中主要以包涵体形式表达，分离纯化后即可获得本发明融合蛋白。

本发明融合蛋白同时具有人心肌肌钙蛋白T和人心肌肌钙蛋白I的抗原活性，可作为时间分辨荧光免疫分析(time-resloved immunofluorometric assay，TRFIA)检测cTnT和cTnI试剂盒的通用参考标准品。

附图说明

图1是cTnT-cTnI-6His-pET24重组质粒的结构图。

图2是融合蛋白CFP10-L-SA-6His的表达SDS-PAGE电泳图，其中1是分子量标准(97.2、66.4、44.3、29、20、14.3KD)，2是工程菌诱导前，3是工程菌诱导后；4是破菌破上清，5是包涵体，6是纯化产物(66.2KD)

图3是cTnT-cTnI融合蛋白作为时间分辨荧光免疫分析双抗夹心法检测cTnT、cTnI的参考标准品制作的标准曲线图。

图4是时间分辨荧光免疫分析双抗夹心法检测cTnT、cTnI的临床应用。

下面将通过实施例进一步说明本发明以及本发明具有的技术效果。

具体实施方式

下述实施例和实验所用的材料及设备如下：

菌株与质粒：大肠杆菌DH5a和Rosetta；原核表达质粒pET24a(Kana^r，Novagen)；原核表达质粒pET24a-cTnT(本室构建)、原核表达质粒pET24a-cTnI(Kana^r，Novagen)(本室构建)。