[发明专利]花粉介导的植物基因转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种花粉介导的植物基因转化方法，特别是指一种利用电穿孔法将外源基因导入植物花粉后，再使花粉经由人工授粉产生带有外源基因的转化种子，且具有高转化率的简易的植物基因转化方法。

背景技术

分子生物学与组织培养的发展，缩短了植物育种及品种改良的研发过程，通过遗传工程学的方法，农业科学家可以将对疾病具有抵抗力的基因、增加营养成分的基因等转化进入作物植株内，以期能栽培出不易因疫病而降低收成量或是提升经济价值的作物。

目前常用的植物基因转化方法有利用微注射法(microinjection)、基因枪(gene gun)、电穿孔(electroporation)等直接将外源基因送至目标细胞的细胞质内的直接法，也有利用载体(例如农杆菌)将外源基因导入植物细胞的间接方法，然而，这些植物基因转化法都需要经历冗长的组织培养与再生过程，而且效率不高，目前，大约只有50种植物可以通过这些方法进行基因转化。

近年有科学家发展出花粉管路径法(pollen tube pathway)，将外源基因附着在花粉(雄配子体)表面以进行授粉，外源基因随着花粉管进入受精卵，以产生具有外源基因的种子，亦有将植物配子体(gamete)或合子(zygote)做为转化标的，并将含有转化基因的配子体或合子进行授粉，以此可省略组织培养的程序，而后亦有人尝试利用花粉做为外源遗传物质载体的转化方法。然而，利用这些方法的转化成功率大多仅维持1-10％，因此转化率低为其最大的缺点。

发明内容

本发明的主要目的也就是为了解决上述现有技术中存在的问题，进而提供一种利用电穿孔法直接将外源基因导入植物花粉后，再经由授粉以产生转化种子且具有高转化率的植物基因转化方法，本方法不受植物种类与转化后可否进行组织培养再生的限制、转化后的植株不易发生突变且不需藉由组织培养与再生即可获得具有转化基因之子代，操作过程亦十分简单快速。

本发明的花粉介导的植物基因转化方法是将外源基因与新鲜花粉溶液混合，形成电穿孔(electroporation)制备溶液，对该制备溶液施以特定电压进行电击后，花粉壁因电击作用而产生孔洞，使得外源基因得以导入花粉而产生具有外源基因的转化花粉，最后利用转化花粉进行授粉以培育出具有外源基因的种子，该种子萌芽后，即可获得具有该外源基因的子代植株。

本发明系利用电压电击(electroporation)来使花粉壁产生开孔，但电压太强或孔洞过大时，可能导致花粉的死亡而降低花粉之存活率，进而降低授粉后获得的种子数，而孔洞过小时，可能使外源基因无法顺利导入花粉内而降低外源基因的转化率，因此，利用本发明方法进行植物基因转化时，电压强度及外源基因片段大小皆为重要的影响参数，本发明同时以电击后之花粉存活率(％)与外源基因导入率(％)作为本发明评估植物基因转化所需使用的最佳导入电压的判断依据，当花粉存活率(％)与外源基因导入率(％)相乘值为最大时的电压值即为最佳导入外源基因的电压值。

本发明的方法可使外源基因经由花粉的遗传物质一起传至下一代并且进行表达，且转化率与前人的方法比较可以得到有效的提升，此方法不仅不需要冗长的组织培养与再生过程，任何开花植物都可以适用，而操作过程简单省时更为本发明的一大优点。

附图说明

图1为电击电压与花粉存活率和外源基因导入率关系图。

图2为花粉存活率染色检测结果。

图3为本发明转化方法所使用的pCAMBIA质粒DNA图谱。

图4为外源基因导入率染色检测结果。

【主要组件符号说明】：

A：不同电击电压下花粉存活率。

B：不同电击电压下外源基因导入率。

具体实施方式

本发明的花粉介导的植物基因转化方法，包括下列步骤：

(1)制备新鲜花粉溶液；

(2)构建外源基因；

(3)将该新鲜花粉溶液与该外源基因混合，形成电穿孔制备溶液；

(4)对该电穿孔制备溶液施以电压进行电击(electroporation)以形成转化花粉；及

(5)利用该转化花粉进行人工授粉以培育具有外源基因的转化种子。

其中，该外源基因的形态可为质粒、载体或裸露DNA(naked DNA)。

因花粉在不同电压电击下会有不同的存活率(％)，且不同大小片段的外源基因在不同电压电击下也会有不同的导入率(％)，该最佳导入电压即花粉存活率与外源基因导入率的相乘值为最大值时的电击电压值。