[发明专利]胸苷酸合成酶在大肠杆菌中的高效表达

说明书

技术领域：

本发明涉及野生型人类胸苷酸合成酶(thynidylate synthase，TS)基因在不发生定点突变情况下的克隆，含有该基因的原核表达载体TS-pET-28b(+)的构建，以及该基因在大肠杆菌中的高效表达。

技术背景：

世界经济的快速发展，人们越来越多接触包括烟草、酒精、病毒与感染、放射和辐射等一系列致癌物质，全球每年约有新发病例1100万。中国癌症发病率占全球的20.3％，每年新发病例超过220万，癌症已经成为全球的主要疾病负担，全球发病率也呈总体上升趋势。研发一种高效，低毒的抗癌药物已经成为各国政府，以及科研工作者孜孜以求的梦想，然而传统的研发手段低效性，限制了对抗癌药物的研究，为了获得一条快捷的研发路径，科学家逐渐倾向于从基因组学以及蛋白质组学的角度，开展研究工作。多年来TS一直是肿瘤化学治疗以及抑制微生物生长的重要靶点。

胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TS，EC 2.1.1.45)是由两个相同的亚单位构成二聚体蛋白，每个亚单位的分子量约36.0kDa，是生物体内催化胸苷酸合成所必需的酶，能催化生物体内的2′-脱氧尿苷-5′-磷酸(dUMP)甲基化形成2′-脱氧胸苷-5′-磷酸(dTMP)，dTMP进一步在细胞内代谢为脱氧胸苷三磷酸(dTTP)，dTTP为DNA合成所必需的前体物质。在快速增殖的细胞中抑制TS活性可使DNA合成受阻，引起细胞死亡，多年来TS一直是肿瘤化学治疗的重要靶点之一。基于TS在肿瘤研究中的重要地位，人们越来越多的去研究TS蛋白自身结构以及TS蛋白与抑制剂之间的关系，这就需要以大量的TS货白为基础。20世纪70年代，Lockshin，Dolnick等从人类肿瘤细胞中成功提取获得胸苷酸合成酶。随着基因异源重组以及原核表达系统，尤其是大肠杆菌表达系统的逐渐完善，通过原核表达来获得大量胸苷酸合成酶成为一条行之有效的方法。Daniel等首次实现人类胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TS)在大肠杆菌中表达，表达量占总蛋白的1.6％。Maley等对野生型TS cDNA中的编码序列进行定点突变，消除了稀有密码子，使TS的表达量达到总蛋白的25％-30％。但是基因序列分析发现人TS基因cDNA的编码序列中含有大量的原核生物稀有密码子，约占TS基因编码序列总数的10.09％(详见表1)，因此如果进行定点突变，将TS cDNA中编码序列中的真核生物密码子逐一突变成原核生物中常用的密码子，可以实现TS蛋白高效表达，但是实验操作量巨大，难度很高，经济适用差。因此急需要研制一种操作简单、高效表达、易于纯化、高效低价制备人TS货白的方法。

发明内容：

本发明的目的在于TS基因不发生定点突变的情况下将野生型TS编码序列与表达载体pET-28b(+)重组，转入含有真核生物稀有密码子的表达菌株Rosetta(DE3)中进行表达，并对发酵条件进行优化，实现了野生型TS基因的原核高效表达。该表达方法与现有的技术相比具有高效的表达率、产品接近天然TS蛋白活性，经济适用性好等特点，为研究TS的酶学性质、酶与抑制剂之间的相互作用提供充足的、廉价的纯酶来源。

本发明的另一目的在于提供一种6聚组氨酸-人类胸苷酸合成酶融合蛋白，减少后续重组TS蛋白纯化的难度。

本发明所述的能够制备人TS蛋白或者6聚组氨酸-人类胸苷酸合成酶融合蛋白的基因工程菌由重组质粒和宿主构成，其中宿主菌指的是Rosetta(DE3)，重组质粒指的是含有野生型人TS编码基因的质粒TS-pET-28b(+)，即重组菌TS-pET-28b(+)/Rosetta(DE3)(CGMCC No.3920)。

本发明提供的基因工程菌的进一步特征在于：所述的重组质粒是pET-28b(+)-PT7-6×His-TS，其中PT7是所述质粒pET-28b(+)的启动子；6×His是组氨酸纯化标签。

本发明所提够的一种高效表达重组人TS蛋白的基因工程菌的构建方法，包括设计PCR上游和下游引物，用PCR从人TS cDNA文库中扩增人TS基因编码片段，并通过表达载体转化到大肠杆菌，用PCR扩增的人TS编码片段经过TA克隆、测序、限制性内切酶酶切，克隆到表达质粒pET-28b(+)中，构建重组质粒TS-pET-28b(+)，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)中，经诱导表达以后SDS-PAGE及Western-blotting鉴别后，证明获得高效表达重组人TS蛋白的基因工程菌。

具体来说，本发明的基因工程菌的构建方法，具体操作如下：