[发明专利]黑素细胞生物活性检测及个体化培养方法

说明书

(一)技术领域

本发明提供了一种黑素细胞生物活性检测方法及个体化培养方法。

(二)背景技术

随着黑素细胞培养技术的日益成熟，使用培养的自体黑素细胞移植成为目前白癜风治疗的研究和发展方向之一。移植的纯黑素细胞能为白癜风区域提供新的黑素细胞来源，通过增殖扩散，使白斑区复色。用培养的黑素细胞作移植最大技术难点在于黑素细胞生长较差，无法在短期内大量扩增。

移植的黑素细胞生物学活性对疗效有着极其重要的作用，挑选选生物学活性好的黑素细胞进行移植可明显提高疗效，目前还没有对移植的自体黑素细胞生物学活性进行检测的研究报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种黑素细胞生物活性检测方法及利用该检测方法对黑素细胞个体化培养的方法。

本发明采用的技术方案是：

黑素细胞生物活性检测方法，所述方法包括：取分离自白癜风患者表皮细胞的黑素细胞，进行传代培养，传代培养过程中进行下述参数评测：

(1)黑素细胞分裂时间DOT计算：每次接种和传代时计数黑素细胞数量，计算获得传代时细胞生长倍数P，根据细胞生长倍数P和生长时间T，按公式计算细胞黑素分裂时间DOT＝0.3T/logP，单位为日；

(2)黑素含量M计算：用二甲基亚砜溶解已知浓度的黑色素，在分光度计475nm处测吸光度A₀，以黑色素含量为横坐标、以对应吸光度值为纵坐标制作标准曲线；在黑素细胞接种和传代时，收集定量黑素细胞离心，加入1mol/l NaOH在37℃水浴溶解细胞30分钟后，在分光度计475nm处测细胞吸光度A，根据标准曲线计算获得每个细胞的黑素含量M，单位ng/cell；

(3)黑素制造量MP计算：MP＝(M₂×P-M₁)/1.3D(P-1)，其中：MP为黑素细胞制造量，单位ng/cell/24hr；M₁为接种时细胞黑素含量，单位ng/cell；M₂为传代时细胞黑素含量，单位ng/cell；P为细胞增长倍数；D为细胞分裂时间DOT，单位日；

(4)结果判断：若传代细胞的DOT值＜4.5，且M、MP数值稳定(M：0.15～0.30ng/cell，MP＜0.10ng/cell/24hour)，则判定该传代细胞处于开始或生长阶段，适宜进行自体黑素细胞移植。

自体黑素细胞悬液移植治疗稳定期白癜风是一种有效的手术方法，接种的细胞浓度为60000～100000/cm²，根据移植面积计算需要细胞量，所以一般要求第三代以后的黑素细胞才能满足移植要求。黑素细胞的生长过程包括开始、生长和衰老三个阶段，移植的黑素细胞要求处在开始或生长阶段。衰老的细胞活性差，在患者移植区不易生长和分化，所以判断移植的黑素细胞的生长阶段很重要。黑素细胞在生长的开始阶段过程中细胞生长快速，黑素含量降低；生长阶段细胞生长快速，黑素含量及黑素制造量维持恒定；衰老阶段细胞生长缓慢，黑素含量和黑素制造量升高。本发明对白癜风患者黑素细胞分裂时间、黑素含量和黑素制造量进行检测分析，从而判断细胞的生长阶段，为移植选择黑素细胞提供了实验依据。

细胞的分裂时间(DOT)是指连续分裂的细胞从第一次完成分裂开始到下一次完成分裂为止所经过的时间，黑素细胞DOT小，表明黑素细胞的分裂和增殖能力强，细胞的生物学活性好，此类细胞移植到患者皮损处的成活率就相对较高，疗效就好。

本发明还涉及一种黑素细胞个体化培养方法，所述方法包括：

(一)取分离自白癜风患者表皮细胞的黑素细胞，于Hu16培养基中进行传代培养，传代培养过程中进行下述参数评测：

1)黑素细胞分裂时间DOT计算：每次接种和传代时计数黑素细胞数量，计算获得传代时细胞生长倍数P，根据细胞生长倍数P和生长时间T，按公式计算细胞黑素分裂时间DOT＝0.3T/logP，单位为日；

2)黑素含量M计算：用二甲基亚砜溶解已知浓度的黑色素，在分光度计475nm处测吸光度A₀，以黑色素含量为横坐标、以对应吸光度值为纵坐标制作标准曲线；在黑素细胞接种和传代时，收集定量黑素细胞离心，加入1mol/l NaOH在37℃水浴溶解细胞30分钟后，在分光度计475nm处测细胞吸光度A，根据标准曲线计算获得每个细胞的黑素含量M，单位ng/cell；