[发明专利]受激发子Nep1诱导的过敏性细胞死亡的调控基因的克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及筛选受激发子诱导的过敏性细胞死亡的调控基因的方法，属于分子生物学领域。

背景技术

由各类病原菌引起的植物病害严重威胁着农业生产安全。而由其产生的激发子和病程相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)是一类重要的信号分子，模仿非亲和互作中植物与病原菌的信号交流，启动不同的级联信号途径，引起过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death，HCD)，诱发植物的系统获得抗性(systemic acquiredresistance，SAR)。

最近，研究发现，植物的HSP90、MAPKKKα、NtLPR1、MEK2、MAPKK和WRKY等基因可调控动物的促凋亡蛋白Bax或非亲和病原菌等生物胁迫诱发的HCD，同时也发现植物病原细菌和卵菌分泌的效应分子可抑制激发子和非亲和病原菌诱发的HCD，但是，植物细胞感受病原菌激发子信号后如何启动早期的细胞死亡程序和一系列基因的表达，最终诱发非寄主植物HCD的分子机制仍不清楚。因此，克隆受病原菌激发子诱发的过敏性细胞死亡的调控基因并分析其功能，有助于揭示植物非寄主抗性的分子机制。

植物病原菌可产生多种激发子，按其化学性质分为蛋白、寡糖及多肽等^[12]。这些激发子均可诱导植物产生抗病性，如elicitin、harpin、INF1、Nep1(necrosis andethylene-inducing peptide 1)、β-葡聚糖及其它的一些蛋白。此外，本实验室还从稻瘟病菌中克隆到一种25kDa的Nep1蛋白激发子MgNep1(结果未发表)。植物细胞识别激发子后会引起Ca²⁺内流、一氧化氮(nitric oxide，NO)和活性氧(active oxyspecies species，AOS)产生；经过一系列的信号传递，诱发HCD和气孔关闭。

病毒诱导基因沉默技术(virus-induced gene silencing，VIGS)是一种快速、高效分析基因功能的方法，为克隆激发子诱发的调控HCD的基因提供了捷径。不少研究者采用该技术分析了本氏烟Nicotiana benthamiana的SIPK、WIPK、EDS1、NPR1、Nbrboh、MAPKKKα、ARF1和WRKY等基因在植物抗病性中的作用^{[5，8，9，23-26]}。本研究采用此技术，利用PVX病毒表达载体构建了本氏烟的cDNA文库，从全基因组范围内克隆到受激发子(fungalNep1)诱发的HCD的调控基因片段。研究结果可望对解释植物的HCD及其对病原菌非寄主抗性的分子机制具有重要价值；为抗病育种提供新的抗病相关基因资源；同时将建立一个克隆受胁迫因子诱发的过敏性细胞死亡调控基因的技术平台。

VIGS为植物功能基因组研究提供了快速高通量的技术平台，近来发展的流线型克隆及接种技术可以在1个月内完成从基因到表型的高通量筛选。本发明在国内外首次采用该技术从烟草全基因组内筛选受激发子Nep1诱导的HCD调控基因，共得到16个能改变激发子诱导的HCD表型的阳性克隆。

发明内容

本发明提供一种受激发子Nep1诱导的过敏性细胞死亡的调控基因的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)以农杆菌为宿主，利用病毒表达载体构建单克隆的烟草cDNA文库；

(2)将上述单克隆的本氏烟cDNA文库的培养菌液注射接种烟草的叶片；

(3)然后将激发子Nep1注射处理上述基因沉默的烟草；

(4)筛选基因沉默后激发子诱导的过敏性细胞死亡表型发生改变的克隆。

该方法还可进一步包括：

(5)对上述阳性克隆进行序列测定和分析。

下面进一步优选的方面：

所述烟草是本氏烟。

所述农杆菌是菌株Gv3101。

所述病毒表达载体是PVX。

第(2)步的接种采用牙签刺伤法或注射接种法。进一步优选，接种是在2-3片真叶完全展开的本氏烟叶片上进行的。

第(2)步的培养菌液通过下述方式培养获得：本氏烟cDNA文库中的克隆在LB液体培养基中30℃培养2天后用10mM的MgCl₂溶液制成菌悬液，使菌体浓度达到10⁵-10⁷CFU/ml。