[发明专利]一种用于筛选抗肿瘤药物的微生物筛选模型

说明书

技术领域

本发明属于药物领域，涉及一种抑制肿瘤细胞DNA复制药物筛选的微生物筛选模型的建立及其应用，本模型非常适合从成分复杂的微生物发酵液中或其他产物中筛选抗肿瘤药物或抗肿瘤抗生素。

背景技术

1、筛选有效抗肿瘤药物的意义

肿瘤是当今世界危及人类生命的一种最常见、最严重的疾病。据世界卫生组织(WHO)统计数字显示，全世界每年新增700万肿瘤患者，因癌症死亡达600万，占总死亡人数的12％。在我国，肿瘤在前十名疾病排名中列第二位，死亡率8.58/10万，占死亡总人数的21.58％。化疗一直都是肿瘤治疗的主要手段。因此，特异性强的有效抗肿瘤药物在肿瘤治疗中具有重要作用。

2、常用筛选抗肿瘤药物的模型和方法及存在的缺陷

(1)MTT-细胞生长抑制法：基本原理是根据活的增殖细胞能代谢MTT，形成一种与细胞增殖程度成正比例关系的蓝紫色的化合物，针对这种化合物而建立的MTT比色分析法具有所用试剂少，仪器简单，耗时少，出结果快等优点。但这种方法必须建立在培养肿瘤细胞的基础上，并且细胞数量、MTT浓度、残留培养液均可影响实验结果。

(2)卤虫(Artemia Sailina)模型和MTT模型组合：利用药物对卤虫的毒性即杀虫作用进行初筛，利用MTT-细胞生长抑制法对具有杀卤虫活性的药物进行复筛，通过测定ID50得到较高活性后选药物。这种方法是通过候选药物对一定数量的卤虫的杀虫率进行初步筛选的，如果卤虫数量少，就会影响实验结果。

(3)³H-TdR掺入法：细胞DNA合成使得³H-TdR的掺入会随之增加，通过对细胞中³H的液体闪烁测定可了解细胞增殖的程度，比较标准对照，判断药物对细胞DNA合成的影响。该法能客观反映多种化疗药物或药物组合对肿瘤细胞生长的不同抑制效果，但由于使用的³H-TdR带有放射性，其使用受到一定限制。

(4)针对蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶进行筛选：近年对肿瘤的发生和发展有了深入的了解，细胞内蛋白磷酸化是细胞信息传递和胞内调控过程的关键反应，针对这些蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶开展研究是抗肿瘤药物研究的一个热点，但进行抗肿瘤药物筛选还不成熟。

(5)端粒酶的筛选：近年来另一个重要进展是发现了端粒酶在维持肿瘤细胞的增殖中起着重要作用，因而端粒酶被认为是恶性肿瘤诊断和治疗的新靶标。但这种筛选模型只能筛选到通过抑制端粒酶而起作用的抗肿瘤药物，具有有一定的局限性。

传统的抗癌药物筛选靶点多是检验药物对肿瘤细胞的直接毒性，除了杀死肿瘤细胞外，对机体正常组织系统也有很大的毒副作用。另外，传统的抗肿瘤药物筛选模型缺乏特异性，筛选过程复杂，有的需要用同位素，不容易操作。而近年来针对与肿瘤细胞发生有关的蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶进行的筛选还不能立刻应用，针对端粒酶而设计的筛选模型的筛选过程比较复杂，其特异性和灵敏性也不是很高，并且选出的侯选药物不能反映药物的结构和作用机制信息。因此，建立新的快速而灵敏的筛选方法，筛选对肿瘤细胞具有特异性的抗肿瘤药物具有非常重要的实际意义。

2、微生物是筛选有效抗肿瘤药物的资源库

微生物具有种类多样、代谢类型多样、产物多样的特点，是筛选新的抗肿瘤药物的重要来源。在当前使用的抗肿瘤药物中，抑制肿瘤细胞DNA复制的药物是其中最重要的一大类，这类药物在肿瘤治疗中具有重要的地位。如何才能从大量丰富的微生物代谢产物库中快速找到有效的抑制肿瘤细胞DNA复制的药物至关重要，迫切需要建立一种简洁方便的，容易操作的，快速准确的容易实现高通量筛选的筛选模型，以便从多样的微生物代谢产物中有目的地筛选有效抑制肿瘤细胞DNA复制的药物或抗生素。

发明内容：

1、基本原理：以本实验室选育的菌株Y作为指示菌株，菌株Y是对作用于肿瘤细胞DNA复制的抗肿瘤药物的敏感菌株，如果某种微生物的发酵液能抑制菌株Y的生长繁殖，那么这种微生物的发酵液中就含有抑制肿瘤细胞DNA复制的抗肿瘤物质或抗肿瘤抗生素。本模型快速、简便和准确，可实现高通量筛选，特别适合从复杂的各类微生物的代谢产物中筛选抗肿瘤药物或抗肿瘤抗生素，也适合从单一化合物中筛选抗肿瘤药物。

2、应用本模型进行抗肿瘤药物筛选的基本方法：本模型适合从细菌、放线菌、酵母菌或霉菌等微生物中分离筛选抑制肿瘤细胞DNA复制的抗肿瘤药物或抗肿瘤抗生素，主要步骤如下：