[发明专利]一种基于转化体的分泌型Rpf因子的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及细菌复活促进因子(Rpf因子)的表达与纯化，特别涉及一种基于转化体的分泌型Rpf蛋白的制备方法及其应用。

背景技术

1、Rpf因子的功能与结构

Rpf(Resuscitation-promoting factor，Rpf)是一种细菌复活促进因子，其功能类似于真核生物的生长因子，可以在皮克(10^-12)水平以自分泌和旁分泌形式促进休眠菌的复活和生长，所以被称为细菌的生长因子。该因子最初是在藤黄微球菌(M.luteus)中发现，Rpf因子除能促使休眠菌复活和生长以外，对正常生长的细菌也有相应的效果；其机制可能是参与了细胞间的信号转导。目前已查明了Rpf氨基酸顺序并确定了编码这种蛋白的基因，相似的Rpf基因广泛分布在高G+C％含量的革兰氏阳性菌中。

藤黄微球菌Rpf蛋白理论上是一个分子量为19kD的蛋白质，氨基端是由75个氨基酸残基组成的保守区，三级结构具有溶菌酶样折叠，形成一个能与寡聚糖结合的裂隙，在第54位有一个非常保守的谷氨酸残基，推测其有催化功能。保守区氨基酸序列与结核分枝杆菌Rpf样蛋白相似(75％的氨基酸残基相同)；羧基端是可变区，由109个氨基酸残基组成，包括与细胞壁肽聚糖结合的LysM结构域，该区域有结合细胞壁的能力；两个结构域由较短的连接区连接。Viktoria等研究琥珀中分离的藤黄微球菌发现：它的Rpf的保守区和可变区与实验室保存菌株区别不大，但连接区区别较大，保存菌株的连接区只有10个氨基酸而分离菌有120个氨基酸之多，推测可能是环境适应的结果；分离菌另一个特点是Rpf结合到细胞壁上，而不释放到周围环境，分离菌抗溶菌酶能力也比保存菌强。

Mukamolova等通过实验证明了藤黄微球菌Rpf蛋白具有胞壁溶解活性：当表达并分泌到细胞质中能够引起大肠埃希氏菌裂解；能够从荧光胺标记的细胞壁上释放荧光；能水解人工合成的溶菌酶底物；能水解藤黄微球菌细胞壁粗提物；使含有细胞壁粗提物的聚丙烯酰胺凝胶形成透明圈。他们测定的Rpf溶菌活性只有溶菌酶的五十分之一，另外，藤黄微球菌Rpf还有弱的胰蛋白酶样活性；当改变Rpf多肽链的第54位的谷氨酸时，其水解肽聚糖的活性降低。

大肠杆菌表达体系中获得的Rpf往往以包涵体形式存在，纯化过程必须先变性再复性才能得到该蛋白，这样剧烈的条件难以保证Rpf的生物活性。毕赤酵母表达系统是近年发展起来的高效分泌表达系统，可对目的蛋白进行翻译后修饰。该表达系统不含有特异性的病毒，不产生毒素，基因工程操作简便，大规模发酵工艺简单，成本低廉。毕赤酵母表达系统的另一优越性就是系统表达产物直接分泌到培养基中，不需复杂的破菌过程，且上清中杂蛋白含量很低，这不但使目的蛋白易于纯化，同时也有益于保持目的蛋白的生物学活性。目前已有200多种重组蛋白在该系统中表达。

2、结核病临床诊断中存在的问题

目前我国常规的TB诊断方法仍是结核菌素试验结合抗酸染色和分离培养。结核菌素试验结合抗酸染色的方法准确率较高，但漏检率亦高，其主要原因是人群普遍接种BCG后，结核菌素试验的诊断价值已大大降低，常用的涂片染色镜检法是抗酸染色法，属低敏感性方法，阳性率不到40％。另外，抗酸性是分枝杆菌属的特征，并非结核菌种的特性。因此，涂片染色镜检阳性时，应仅报告抗酸杆菌阳性，但临床上往往是将“抗酸杆菌阳性”等同于“结核菌阳性”，这实际上是临床医生结合其它有关的临床资料的综合诊断，并非细菌学的认定。有报道指出，临床诊断为TB的细菌分离株中，经鉴定后发现有2％～5％为非结核分枝杆菌。分离培养的检出率也很低，尤其对于持留菌、休眠菌及代谢异质菌无法成功培养。

国内外近年来尝试建立了几种新的诊断方法，如通过检测抗MTB抗体或通过PCR法检测MTB的核酸等来辅助诊断结核病，这些方法的敏感性较前述方法高，但检出率一般也仅在70％左右，而且假阳性率亦较高。同时由于耐药菌株的大量出现，治疗需要药物敏感实验的指导，虽然利用基因芯片、单链构象多态性等方法可以进行快速耐药菌株鉴定，但由于一些引起耐药的基因突变位点尚不清楚、一些突变位点为无意义突变、新抗生素使用等，使其敏感性不足80％，且试验结果必须用表型方法验证。所以常规药物敏感实验仍是临床上最常采用的方法。