[发明专利]一种赤潮藻种快速鉴定的方法

权利要求书

1.一种赤潮藻种快速鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、实验藻种f/2及其衍生培养基的配制

b、引物设计与验证

c、实验藻种18S rDNA片段的获得

d、PCR优化及扩增

e、模拟酶切和实际酶切对照实验

f、RFLP区分鉴别赤潮藻种。

2.根据权利要求1所述赤潮藻种快速鉴定的方法，其特征在于，所述步骤a为：

f/2微量元素溶液：向950mL重蒸水中加入成分：FeCl3·6H2O，Na2EDTA·2H2O，CuSO4·5H2O，Na2MoO4·2H2O，ZnSO4·7H2O，CoCl2·6H2O，MnCl2·4H2O，定容至1L，高温灭菌；

f/2维生素溶液：向950mL蒸馏水中加入200mg vit.B1，加入1ml vit.H和vit.B12的储存液，定容至1L，过滤灭菌，置于4℃；

f/2培养基：向950mL蒸馏水中加入成分：NaNO3，NaH2PO4·H2O，Na2SiO3·9H2O，，并定溶至1L，高温灭菌，储存于4℃备用；

f/2-Si培养基：孔径为0.22μm的滤膜过滤新鲜海水1L，高温灭菌，配方同f/2培养基，不加Na2SiO3·9H2O；

f/50培养基：孔径为0.22μm的滤膜过滤新鲜海水1L，高温灭菌，冷却至室温后中添加40μl营养元素，40μl微量元素溶液，20μl维生素溶液，补充过滤新鲜海水至1L。

3.根据权利要求1所述赤潮藻种快速鉴定的方法，其特征在于，所述步骤b为：

(1)实验藻种目标序列(18S rDNA)信息的获得和比对

基于NCBI中的GenBank DNA序列数据库的相关信息，获取实验藻种的18S rDNA序列的相关信息，并运用DNAstar软件对序列信息进行对比，以搜寻合适的设计引物的区域；

(2)实验藻种目标序列(18S rDNA)对比和引物的设计

根据DNAstar软件序列对比的结果，通过Primer Premier-v软件对引物相关条件的设置，设计出最优引物。

4.根据权利要求1所述赤潮藻种快速鉴定的方法，其特征在于，所述步骤c为：

(1)实验藻种基因组DNA的提取与纯化

(2)PCR反应

(3)PCR的优化

选取18S rDNA序列，设计出引物1、引物2、引物3，其序列为：

引物1：18S(R)：AACCTGGTTGATCCTGCCAGT

18S(F)：TGATCCTTCTGGAGGTTCACCTAC

引物2：18S rDNA(R)：TGTCTCAAAGATTAAGCCATG

18S rDNA(F)：ACTTCTCCTTCCTCTAAGTGA

引物3：18S rDNA(1)：ACCTGGTTGATCCTGCCAGT

18S rDNA(2)：TCACCTACGGAAACCTTGT。

5.根据权利要求1所述赤潮藻种快速鉴定的方法，其特征在于，所述步骤d为：

(1)PCR反应中Mg2+的浓度的优化

(2)PCR反应中模板起始浓度的优化

(3)PCR反应中引物起始浓度的优化

然后进行PCR扩增。

6.根据权利要求1所述赤潮藻种快速鉴定的方法，其特征在于，所述步骤e为：将实验藻种序列信息录入excel软件，并结合实验用到的限制性内切酶的酶切信息，通过excel软件，作出酶切片段数和长度的信息，建立初级酶切信息数据表；

根据模拟数据表建立的信息，进行筛选，从中挑选出限制性内切酶，运用Vector NTI Suite 9软件确定凝胶电泳的条件，然后对实验藻种序列进行模拟的酶切，并跑出模拟电泳图，根据此初步判断其区分鉴别程度；

选取部分实验藻种进行酶切实验，并与的模拟实验结果进行比对，验证模拟实验和实际试验的吻合程度，其中，

反应体系为：总体积30μl，其中18S rDNA扩增产物15μl，酶切反应缓冲液5μl，内切酶3μl，灭菌重蒸水7μl；

反应时间为：65℃条件下90min，其酶切产物也用凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶浓度为1％，电压100V，电泳30min，然后在凝胶成像系统中进行分析。