[发明专利]一种检测CEBPA基因突变的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测CEBPA基因突变的试剂盒。

背景技术

一、急性髓性白血病分子标志物的研究概况

急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)是由髓系造血干/祖细胞发生累积性获得性基因改变导致正常的细胞增殖、分化和凋亡途径发生改变的一种恶性疾病，是成人急性白血病的主要类型，分类复杂，发病机制至今尚不明确，在临床及遗传学上均具有显著异质性。成人AML患者中大约55％可鉴定出细胞遗传学异常，大约45％的AML患者表现为正常核型。近来在正常核型AML中鉴定出了多种有重要临床预后价值的分子标记，通过分子标记进行危险分层在诊断、治疗中的作用越来越大。目前国际上更倾向于根据病人对治疗的反应性及结局将其分为预后好、预后中等、预后差三类，其中细胞遗传学改变是最常用的对预后进行分层的标准，被纳入中危组的正常核型AML是细胞遗传学分类中人数最多的一个亚型，也是目前研究的热点之一。最新公布的WHO白血病分类标准中，强调在初诊评估时就应对骨髓样本进行全面的细胞遗传学分析。AML亚类的定义涉及特异染色体易位和基因突变，常见的NPM1、CEBPA、FLT3、RUNX1和KIT突变，在AML中有重要诊断和预后意义。特别是NPM1、CEBPA和FLT3突变，在新修订的分类标准中已成为AML重要的预后参考指标，可能成为新的治疗靶点。2010年发表的欧洲国际专家组的AML诊治方案中(Blood，2010，115：453-474)，认为临床工作中应检测NPM1、CEBPA和FLT3突变，至少正常核型AML在治疗前均应检测这些重要的突变。这些突变可单独出现或非随机的联合出现，且不能孤立的看待这些联合突变，即使是同一亚型中同时出现的不同基因改变，也会有不同的临床过程。

二、CEBPA基因与急性髓性白血病

1、CEBPA基因

由基因突变导致的细胞增殖、分化和细胞凋亡途径的改变是急性髓性白血病的发病基础。近年来，一系列的研究表明，系列特异性转录因子在正常的造血分化过程中具有重要作用，其功能的破坏、丧失常与AML的发生有关。其中髓系转录因子CCAAT/增强子结合蛋白-A(CEBPA)在造血系统中只表达于髓系细胞，是髓系祖细胞增殖与分化过程中一个重要的转录因子，具有诱导粒系的分化和抑制增生的作用。研究发现CEBPA基因的突变和表达水平改变与AML有关。

CEBPA属于CEBP转录因子家族成员，含358个氨基酸，由定位于染色体19q13.1的CEBPA基因编码而成。CEBPA基因无内含子，cDNA全长2591bp(NM_004364.3)，内含多个翻译起始位点，翻译起始位点多样性是由CEBPA基因5’端的开放读码框决定的。CEBPA mRNA可翻译表达两种蛋白CEBPA p42(42kDa)和CEBPA p30(30kDa)。CEBPA p42包括3个转录激活结构域(TE-I、TE-II和TE-III)和亮氨酸拉链碱性区(bZIP)，通过亮氨酸拉链CEBPA与DNA结合，并与其他蛋白形成同源或异源二聚体。与CEBPA p42相比，CEBPA p30缺乏转录调节结构域，它刺激相关靶基因转录的效率明显降低，且对CEBPAp42介导的靶基因转录激活产生抑制作用。这是由于CEBPA p42自身形成CEBPA同源二聚体，和CEBPA p30形成CEBPA异二聚体，后者的DNA结合能力和转录激活能力减弱，同时还缺乏抗有丝分裂活性。

CEBPA在造血系统中的作用包括：①诱导粒系分化：CEBPA基因表达起始于造血干细胞(HSC)阶段，在髓系祖细胞向粒细胞分化过程中发挥重要调节作用，其在粒/单核祖细胞(GMPs)上的表达水平随粒细胞和巨噬细胞的发展而逐渐上调；CEBPA的破坏可以导致髓系祖细胞向粒系分化进程的阻滞；有研究发现，在CEBPA缺失的小鼠中没有成熟的粒细胞存在，而其他细胞系不受影响；②抑制细胞增殖：通过在体外对基因敲除小鼠的分析和白血病细胞的检测，已经对CEBPA促进细胞生长停滞的能力进行了一定的研究，并且建立了数个关于CEBPA诱导细胞生长停滞的模型；③抑制细胞凋亡：目前的研究提示CEBPA可以通过与核因子NF-KB p50相互作用诱导bcl-2表达，从而抑制造血细胞株Ba/F3凋亡；研究还发现，在低危的AML患者中CEBPA基因与bcl-2 RNA水平密切相关，且通过诱导bcl-2表达来抑制细胞凋亡。

2、CEBPA基因突变