[发明专利]海洋甲壳类动物支原体培养基及分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及到一种支原体培养基及分离纯化方法。

背景技术

现有的支原体属于原核细胞生物，是目前能在无活性细胞培养基中独立生存、自我繁殖的最小微生物，无细胞壁结构，有高度的多形性，可透过微孔滤膜。支原体除了能引起人类传染病外，还能引起家畜、家禽和作物病害(Razin S.Peculiar properties ofmycoplasmas：the smallest self-replicating prokaryotes.FEMS Microbiol Lett，1992，79(1-3)：423-431.)。自1937年分离出第一株人系支原体以来，迄今已有120余种支原体被陆续报道，且多见于哺乳动物和节支动物昆虫纲种类(Razin S.Yogev D.Naot Y.Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas.Microbiol Mol Biol Rev.1998，62(4)：1094-1156.)。然而有关甲壳纲的支原体，目前国内外均极少报道。杨季芳等(杨季芳，中国对虾枝原体超微结构及宿主的主要超微病理变化，海洋与湖沼，1997，Vol.28，No.2；杨季芳，中国对虾流行性肝胰腺坏死综合症研究I病毒和类枝原体合并感染对虾肝胰腺，1993，东海海洋，Vol 11，NO3，34-39.)从养殖中国对虾肠道结节病和白斑综合症中发现支原体与细菌及支原体与白斑综合症病毒的混合感染。无致病性支原体在环境中大量存在并在健康动物体内长期存在，携带支原体的动物在没有受到应激胁迫之前并不会表现任何症状。然而，从患病死亡的对虾眼、鳃、脑中分离的支原体纯培养物能够使健康对虾发病，或使健康动物更容易受到病毒和细菌的感染(Ghadersohi A，Leigh O.Isolation，charactersation and DNA analysis of Mycoplasma spp.from moribund prawnsPenaeus monodon cultured in Austualia.Dis Aquat Org，1999，35：53-61)。

对甲壳动物支原体进行科学研究，首要要解决的瓶颈问题是制备适合甲壳动物支原体体外生长繁殖的培养基。目前用于人类及畜禽支原体培养的培养基均不能满足甲壳动物支原体的生长需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种海洋甲壳类动物支原体培养基。

本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种海洋甲壳类动物支原体培养基分离纯化方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该海洋甲壳类动物支原体培养基，包括液体培养基和固体培养基，其特征在于：

将

支原体肉汤培养基        12.0～15.0g

0.4-1wt％苯酚红          2.35～3.00mL

重蒸水                  470～600mL

在pH为7.0-8.0、110℃-121℃的条件下灭菌10-20min后，加入5-30mL小牛血清在56℃灭活30min，然后再加入10-40v％新鲜酵母浸出液5-20mL、5-10wt％葡萄糖溶液0.5-3mL、5-15wt％醋酸铊水溶液0.1-0.5mL和5-20mg/mL青霉素0.5-2mL混合均匀得到所述的液体培养基；

将

支原体肉汤培养基        12.0～15.0g

重蒸水                  470～600mL

琼脂粉                  0.94～1.2wt％

在pH7.0-8.0、110℃-121℃条件下灭菌10-20min，待冷却至55～60℃后，加入已过滤除菌的小牛血清5-30mL、10-40v％新鲜酵母浸出液5-20mL、5-15wt％醋酸铊水溶液0.1-0.5mL和5-15mg/mL青霉素0.5-2mL，混合均匀后将混合液倾注到灭菌平板上制成固体培养基；上述琼脂粉的用量为每100mL固体培养基加入0.94-1.2g。

其中，所述新鲜酵母浸出液的制备方法如下：