[发明专利]林荫银莲花的离体快速增殖方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种林荫银莲花的离体快速增殖培养方法及应用。

技术背景

林荫银莲花(Anemone flaccida Fr.Schmidt)系毛茛科(Ranunculacease)银莲花属(Anemone)多年生 草本植物，其干燥根茎俗称“地乌”，具有祛风湿、助筋骨、消肿止痛等功效，是一种珍稀的高山药材。 每年3～5月为林荫银莲花地上部生长发育时期。基生叶1～2片，长叶柄，五角形，长2～7cm，宽3～ 10cm。根状茎近圆柱形，最大直径为1cm，3～5年方能采收入药。野生资源主要分布于长江中下游各省 海拔1500～3000m的山坡林下阴湿处，在中国湖北省的鄂西山地分布相对集中^[1]。

目前，五类新药“地乌风湿安胶囊”对类风湿性关节炎有良好的治疗作用，且毒副作用很小，已进入 三期临床试验，该成药将具有广阔的市场前景^[2]。林荫银莲花野生资源珍稀，自然条件下生长、繁殖缓慢， 严重限制了地乌成药的开发利用。因此，利用快速增殖离体林荫银莲花的培养方法对其进行快繁就成为解 决这一矛盾的关键。

截至目前，国内外除本课题组的工作外，关于林荫银莲花的组织培养技术，均尚未见报导。自2006 年以来，本课题组对林荫银莲花的快繁技术从实验室组培到组培苗原产地的炼苗、栽培进行了系统研究与 开发，以地乌根状茎芽为外植体诱导不定芽，再对不定芽生根培养后得到林荫银莲花无菌组培苗已获得成 功^[3]。总结前期工作后发现，要实现离体培养条件下快速繁殖林荫银莲花完整植株，使其能够实现人工栽 培的目的尚存在以下一些问题需要解决：(1)培养基的各种成分针对性不强，增殖效率较低；(2)缺乏关 于试管苗繁殖系数和生长状况等生物学性状的详细实验数据；(3)试管苗生根率虽较高，但其再生根很细 且弱，根系质量差，影响对营养物质的吸收，特别是缓苗期较长，移栽成活率低；(4)现有技术未见有对 再生林荫银莲花试管苗的炼苗及实地移栽的报道，更未见到关于利用离体培养林荫银莲花用于生产应用的 实际结果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种林荫银莲花的离体快速增殖方法及应用，以提高离 体条件下林荫银莲花再生植株的生根频率，提高根的质量，进而提高林荫银莲花的繁殖效率。

本发明通过以下技术方案实现：

1、一种林荫银莲花的离体快速增殖方法，其步骤如下所述：

A、不定芽的增殖培养

1)选择经初代培养于MS，附加6-苄基腺嘌呤2.0mg/L，萘乙酸0.2mg/L，蔗糖30g/L和琼脂 0.8％的培养基上诱导出的林荫银莲花不定芽，在无菌条件下将其分切成0.5～1.0cm²的芽块；

2)将步骤1)的芽块接种于1/2MS，附加6-苄基腺嘌呤1.0mg/L，萘乙酸0.4mg/L，激动素0.5mg/L， 水解酪蛋白250～750mg/L，琼脂0.8％和蔗糖20～30g/L的培养基上，培养温度为17±2℃，光照强 度为3000Lux，光照周期为12h/d，培养周期为30d，以得到不定芽；

B、拟球茎诱导

1)选择经A步骤增殖培养后获得的不定芽为外植体，在无菌条件下去除叶片，将其分切成0.5～ 1.0cm²的芽块；

2)将步骤1)的芽块接种于MS，附加6-苄基腺嘌呤1.0mg/L，萘乙酸0.4mg/L、激动素0.5mg/L， 水解酪蛋白500mg/L，琼脂0.8％和蔗糖20～30g/L的培养基上，培养温度为17±2℃，光照强度为 3000Lux，光照周期为12h/d，培养周期为30d，得到健壮的无菌芽苗；

C、生根培养

1)将步骤A或步骤B培养得到的直径为≥1cm，高为≥1.5cm的不定芽或无菌芽苗为外植体， 除去其叶片，将其基部分切为1cm²的芽块；

2)将步骤1)的芽块接种于1/2MS，附加萘乙酸0.5mg/L，吲哚丁酸0.5mg/L，琼脂0.75％和蔗 糖20～40g/L的培养基上，培养温度为4±0.5℃，暗培养，培养周期为40d，获得带根无菌苗；

D、炼苗移栽