[发明专利]一种红细胞吸附法联合RT-PCR检测具有血凝性病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种红细胞吸附法联合RT-PCR检测具有血凝性病毒的方法，具体涉及一种以新城疫为研究对象，采用红细胞吸附法联合RT-PCT检测具有血凝性病毒的方法。

背景技术

有些病毒能吸附于鸡、火鸡和鸭等动物的红细胞表面，并引起红细胞凝集，这种特性与病毒囊膜上的纤突所含血凝素和神经氨酸酶有关。具有这种特性的病毒主要有新城疫和禽流感等。

新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种极易传染的毁灭性疾病，典型症状是呼吸道、消化道黏膜出血，最常侵袭家鸡，也能感染许多其它家禽和野鸟，人也有易感性。该病1926年首次发现于印尼，同年发现于英国新城，因此得名新城疫。该病分布于世界各地，1928年我国已有该病的记载，1935年在我国有些地区流行。新城疫感染的死亡率高达100％，同高致病性禽流感同属A类病，给世界养禽业带来巨大的威胁。目前用于检测NDV的方法有血凝和血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验、病毒分离法等，这些方法虽然可以对病原作出诊断，但却存在费时、代价高、敏感性和稳定性不够好的缺点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种红细胞吸附法联合RT-PCR检测具有血凝性病毒的方法。以新城疫病毒(NDV)作为研究对象，选取NDV的核衣壳蛋白的核苷酸序列设计一对引物，利用其能吸附于鸡、火鸡和鸭等动物的红细胞表面这一重要生物学特性，建立一种适合于NDV快速检测的红细胞吸附联合RT-PCR法。本发明方法敏感性和稳定性都很好，具有较大的临床运用价值，也同样适合于禽流感等具有血凝性病毒的检测。

本发明的红细胞吸附法联合RT-PCR检测具有血凝性病毒的方法，具体包括以下步骤：

1)制备红细胞

用灭菌注射器吸取柠檬酸抗凝剂1mL(其用量为所需血量的1/4体积)，从鸡翅静脉抽血4mL，置灭菌离心管内，加灭菌PBS10mL，以2000r/min离心5min，弃上清液，再加灭菌PBS 10mL悬浮血球，再以2000r/min离心5min，如此将红细胞洗涤三次即可。

2)红细胞吸附NDV

取出从鸡场采集的污染粪便0.1g，加2mLPBS振荡混匀，使病毒溶解于PBS中，以10000r/min离心5min，取离心后上清液加约50uL的红细胞，室温作用1小时，2000r/min离心5min，弃上清，沉淀即为含有NDV的红细胞。如果污染的病料中含极少NDV，可通过红血球多次吸附以集中NDV。

3)病毒RNA提取

RNA提取按Trizol-A⁺提取总RNA说明书进行。

4)RT-PCR扩增

i)引物设计与合成

根据GenBank上已公布的NDV-NP基因序列，设计合成了一对特异性引物，能扩增578bp的基因片段。引物序列如下：

NP-F1：5′TATTCTGTCTTCGGATTGCT 3′

NP-R1：5′GCTCCCACCTGCTGTATT 3′

以上引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

ii)反转录

冰上操作，在PCR管中依次加入焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水6μL，5×反转录酶Buffer 4μL，dNTP Mixture(10mM)1μL，NP上游引物F11μL(10μM)，RNA酶抑制剂1μL，NDV病毒RNA 5μL，AMV反转录酶2μL(5U/μL)，总体积20μL。在冰上混合后，室温放置10min，42℃1h后冰上冷却2～3min；所得的反应液可立刻用于PCR反应或-20℃保存备用。

iii)PCR反应

在PCR管中依次加入反转录产物2μL，10×Buffer(Mg²⁺free)2.5μL，MgSO₄2μL，dNTP(10mM)1μL，NP-F1、NP-R1(10μM)各1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.25μL，ddH₂O 15.25μL；总体积25μL在冰上混合。

PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，49℃退火25s，72℃延伸60s，循环32次，最后72℃延伸10min。

5)敏感性试验