[发明专利]基于磁珠提取细菌基因组试剂盒及其提取方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，特别是提供了一种基于磁珠提取细菌基因组DNA的试剂盒及其提取方法。

技术背景

核酸是现代分子生物学、生物医学研究中的重要课题。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成上也占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。因此，无论是进行核酸结构与功能的研究，还是进行基因改造工程、蛋白质工程，首先需要对核酸进行分离与纯化。

从复杂生物样品中分离纯化核酸或者制备核酸模板是许多分子生物学技术中的关键步骤。由于样品基质中存在大量的细胞裂解产物如蛋白质和其他杂质，它们可能抑制下游处理中使用的聚合酶和限制性内切酶的活性，也可能导致目标核酸的降解，因此，在进行核酸测序、扩增、杂交、酶切等操作之前都需要首先采取适当的方法将核酸从混合物中分离出来。常规的核酸提取方法涉及细胞裂解、有机溶剂萃取、沉淀和离心等步骤，传统方法如苯酚氯仿抽提法、Silica管柱法、高盐溶液法等。

细菌基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等，而随着PCR及荧光定量PCR技术的迅速发展，一些食品致病菌(微生物)：如金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、出血性大肠杆菌O157:H7、单增李斯特、沙门氏菌、阪崎肠肝菌等革兰氏阳性或革兰氏阴性菌的分子检测得以快速、准确的鉴定，也需要对其进行基因组DNA的提取。目前，商品化核酸提取试剂盒的使用具有方便、快捷、无需有机溶剂酚仿抽提等优点，大大的替代了传统的核酸提取方法。尤其是新近发展起来的基于磁性微粒的提取方法使得核酸纯化过程大为简化，已经在欧美国家获得了广泛的应用。

基于磁性微粒的核酸纯化技术是利用亲水性磁性微粒吸附样品溶液中的核酸分子，在外加磁场作用下将负载核酸的磁性微粒从样品溶液中分离出来，经适当清洗后，加入适当的溶液使得核酸从磁性微粒上脱附即得到纯化核酸。核酸纯化步骤不仅可以在常规的试管中以手工方式进行，也可以在96孔或382孔微孔板中以自动化方式进行。基于磁性微粒的核酸分离纯化试剂盒以其操作简便快捷和省时省力的特点，成为目前分子生物学和基础研究的理想的辅助工具。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于磁珠提取细菌基因组DNA的试剂盒及其提取方法，特别涉及葡萄球菌属、链球菌属等革兰阳性细菌细胞壁难于裂解的困难，试剂盒中提供的高效溶菌酶工作液用于裂解革兰阳性细菌细胞壁。通过菌体蛋白沉淀液去除大部分残壁菌体及蛋白等杂质，再利用单分散磁性微球特异性吸附基因组DNA；仅需简单的漂洗步骤后，就可以将磁性微球上的基因组DNA洗脱下来。

本发明的试剂盒包括溶菌酶工作液、细菌重悬裂解液、RNA酶工作液、菌体蛋白沉淀液、磁珠、异丙醇、漂洗液、DNA洗脱液等八种组分，各组分内容如下：

溶菌酶工作液：10-20mmol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)盐，PH值7.0-8.0、1-4mmol/L螯合剂、体积分数0.8-1.2％ Trition-X-100，溶菌酶的终浓度为20-30mg/mL；

细菌重悬裂解液：10-20mmol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)盐，PH值7.0-8.0、1-4mmol/L螯合剂、50-100mmol/LNa盐、质量浓度2-4％的SDS(十二烷基硫酸钠)和终浓度0.1-0.4mg/mL的蛋白酶K；

RNA酶工作液：为核糖核酸酶A，其终浓度10-20mg/mL；

菌体蛋白沉淀液：5-8mol/L胍盐、2-3mol/L Na盐，PH值6.5-7.5；

磁珠：粒径1-2μm的单分散磁性微球；

异丙醇：分析纯的异丙醇；

漂洗液：10-20mmol/L Tris盐，PH值6.8-7.2、100-200mmol/L Li盐、1-4mmol/L螯合剂与无水乙醇按1∶3-5的体积比混合而成；

DNA洗脱液：10-20mmol/LTris(三羟甲基氨基甲烷)，PH7.5-8.5。

本发明上述试剂盒的提取方法步骤如下：