[发明专利]CYP2E1基因SNP检测特异性引物、液相芯片和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及CYP2E1基因SNP检 测特异性引物、液相芯片和检测方法。

技术背景

二甲基亚硝胺D-脱甲基酶(Cytochrome P450 2E1，CYP2E1)是代谢内源性物质和外源 性物质的细胞色素酶P450超家族中的一员，主要参与亚硝胺及其前致癌物N-亚硝基二甲胺和 N-亚硝基四吡咯烷的代谢，同时参与酒精的氧化代谢和产生自由基而启动脂质过氧化。 CYP2E1在解毒和代谢方面较CYP450其它酶更为重要，对乙醇、亚硝胺、苯类及四氯化碳等 毒性物质具有特异的代谢作用。同时，CYP2E1基因多态性与肺癌、肝癌和鼻咽癌等多种肿瘤 的发生、发展密切相关。目前CYP2E1作为一种重要的生物转化酶，其遗传多态性与多种疾病 的易感性已成为临床研究的热点。

有研究表明，中国人群中存在CYP2E1*2、CYP2E1*3和CYP2E1*5型突变体。CYP2E1*2 是由于外显子2上第1168位G→A突变引起第76位氨基酸由Arg(R)变为His(H)，导致酶活的降 低，该基因型在中国人的突变率为2.56％。而CYP2E1*3则是由于外显子8第10059位的G→A 突变引起氨基酸第389位由Val(V)变成I1e(I)，但酶活并无明显改变。CYP2E1*5是发生在5’端 非编码区的Rsa I/Pst I位点多态性，与肺癌易感性关系密切。携带CYP2E1*5野生基因型个体 发生肺癌的风险是携带CYP2E1*5突变基因型个体的1.55倍，CYP2E1*5突变基因型可能是肺 癌发生的保护和抑制因素，CYP2E1*5基因型中的Rsa I变异等位基因的存在能降低肺腺癌的 发病率，野生型CYP2E1*5Rsa I却能增加肺腺癌的易感性。在CYP2E1基因的5’端非编码区， Rsa I和Pst I多态呈完全连锁，野生型等位基因(c1)的第1053核苷酸存在一个Rsa I酶识别部位， 而突变型等位基因(c2)在该处发生点突变(C→T)，使Rsa I酶识别部位消失；相反野生型等位 基因(c1)的第1293位核苷酸不存在Pst I酶识别部位，但发生点突变(G→C)后，在该处形成 Pst I酶识别部位，从而产生(c2)等位基因。两种等位基因形成A型(c1/c1)、B型(c1/c2)和C 型(c2/c2)3种基因型，研究发现C型基因增强子活性是A型基因增强子活性的10倍，Pst I和 Rsa I限制性片段多态性在转录水平影响CYP2E1的表达，c2等位基因使其表达增加。CYP2E1 的基因多态性使其转录活性有明显差别，从而导致CYP2E1在体内的活性不同。

目前国内外几乎没有检测CYP2E1基因多态性的产品上市，大部分的报道仍处于实验研究 阶段，尚未商品化。已有的检测技术主要建立在传统固相芯片和PCR的基础上，传统固相芯 片价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差，而其它以PCR为基础检测技术，主 要有荧光定量PCR和直接测序法，这些技术存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点， 同时检测通量存在局限性，不能满足检测应用的需要。

发明内容

本发明的目的之一是提供CYP2E1基因SNP检测液相芯片。该液相芯片可用于检测CYP2E1 基因的正常基因型以及三种常见等位基因型G1168A、C1053T和G1293C的变异。

实现上述目的的技术方案如下：

一种CYP2E1基因SNP检测液相芯片，主要包括有：

(A).针对CYP2E1基因的SNP位点分别设计的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag 序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列分别为：针 对G1168A位点的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8、针对C1053T位点的SEQ ID NO.9及SEQ  ID NO.10、和/或针对G1293C位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12；所述tag序列选自SEQ ID  NO.1-SEQ ID NO.6中的序列；

(B).分别包被有特异的anti-tag序列的微球，上述每种微球具有不同颜色编码；所述anti-tag 序列选自SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.18中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所 选的tag序列互补配对；