[发明专利]供体角膜多种病毒的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术检测供体角膜病毒感染领域，具体涉及供体角膜重大致病病毒丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒I型(HIV1)和狂犬病毒(RV)的快速检测试剂盒及检测方法。

背景技术

我国眼库的生物安全性极差，没有控制供体角膜的医源性感染问题。主要是大部分眼库供体的全身情况的资料不全，意外死亡的捐赠者甚至没有全身情况的医学资料，存有传染各型肝炎、狂犬病和艾滋病的很大风险，所以在供体角膜十分奇缺的情况下，要在保障安全的前提下，尽可能发挥供体角膜的临床使用范围。目前我国眼库的主要问题是如何建立一套利用结膜组织快速、准确筛查供体角膜感染病毒的方法。

供体角膜的实验室检测方法目前主要包括血清免疫学方法和基因检测法。血清免疫学方法可由检验科完成，该方法价格便宜，操作简单，但是灵敏度低，容易出现假阴性，可作为一种初筛手段。并且该方法在无法获得供体血样的情况下无法实行。基因检测可分为定性检测和定量检测，目前的研究发展趋势是迅速发展能够快速、定量检测并且成本较低、易于推广的新技术。聚合酶链反应(PCR)技术虽已被广泛用于核酸分析，但普通PCR的假阳性污染和定量准确度一直困扰着人们。它依赖于各种不同类型PCR的后处理过程，而这些处理过程很易使数量巨大的PCR产物飞散到空气中，使PCR的假阳性污染成为大规模临床应用的最大问题。另一方面，所有这些方法的定量都是针对PCR终产物来进行的，而PCR的平台效应大为干扰了PCR的原始模板数量和终产物之间的相关性，使定量准确度难以提高。

发明内容

本发明的目的是提供供体角膜重大致病病毒HCV、HIV1、RV的快速检测试剂盒及检测方法，以弥补现有技术的不足。

研究发现，FQ-PCR(Real Time Fluorescent Quantity Polymerase Chain Reaction)方法采用完全闭管检测，不需PCR后处理，避免了交叉污染；同时采用实时检测技术，所得Ct值和原始模板数量完全呈线性相关，定量准确率极高。

本发明所采用的技术路线是：本发明针对供体角膜重大致病病毒HCV、HIV1、RV的核苷酸序列，设计合成相应的正向和反向引物、荧光探针和阳性工作标准品。将梯度稀释的阳性工作标准品分别作为模板进行FQ-PCR反应，得到各自的Ct值，通过Ct值与起始模板浓度的对数值之间存在的线性关系制作出标准曲线。HCV、HIV1和RV的遗传物质是RNA，提取供体眼球结膜组织总RNA，然后逆转录为cDNA后，结合荧光探针的扩增检测技术，通过荧光信号的变化检测病毒RNA的拷贝数，从而确定供体角膜组织内是否感染致病病原体HCV、HIV1或RV及其数量。

本发明的具体技术方案如下：

本发明所涉及的供体角膜重大致病病毒HCV、HIV1、RV的快速检测试剂盒由RNA提取试剂、RNA反转录和扩增试剂和阳性工作标准品组成。

其中RNA提取试剂为NucleoSpin RNA II试剂盒(Macherey Nagel)；RNA反转录和扩增试剂包括2X反转录PCR预混试剂，Taq DNA聚合酶，反转录酶(天根)，正向及反向HCV引物，HCV荧光探针，正向及反向HIV1引物，HIV1荧光探针，正向及反向RV引物，RV荧光探针，无核酸酶的蒸馏水，HCV阴性对照，HCV阳性对照，HIV1阴性对照，HIV1阳性对照，RV阴性对照，RV阳性对照；阳性工作标准品分别为含有HCV正向和反向引物扩增的目的序列的pUC57-HCV质粒，含有HIV1正向和反向引物扩增的目的序列的pUC57-HIV1质粒，含有RV正向和反向引物扩增的目的序列的pUC57-RV质粒。

一.HCV、HIV1或RV引物、荧光探针和阳性工作标准品序列如下：

HCV：

正向HCV引物：CTCCCGGGAGAGCCATAGT

反向HCV引物：CAAGCACCCTATCAGGCAGTA

HCV荧光探针序列：FAM+CGGAACCGGTGAGTACACCGGA+TAMRA

HCV扩增片段长度为182bp。

HCV阳性工作标准品的目的序列为：

ttagtatgagtgtcgtgcagcctccaggaccccccctcccgggagagccatagtggtctgcggaaccggtgagtacaccggaattgcca

ggacgaccgggtcctttcttggataaacccgctcaatgcctggagatttgggcgtgcccccgcaagactgctagccgagtagtgttgggtc