[发明专利]供体角膜多种病毒的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种供体角膜多种病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒由RNA提取试剂、RNA反转录和扩增试剂和阳性工作标准品组成；其中RNA提取试剂为NucleoSpin RNA II试剂盒；RNA反转录和扩增试剂包括2X反转录PCR预混试剂，Taq DNA聚合酶，反转录酶，正向及反向HCV引物，HCV荧光探针，正向及反向HIV1引物，HIV1荧光探针，正向及反向RV引物，RV荧光探针，无核酸酶的蒸馏水，HCV阴性对照，HCV阳性对照，HIV1阴性对照，HIV1阳性对照，RV阴性对照，RV阳性对照；阳性工作标准品分别为含有HCV正向和反向引物扩增的目的序列的pUC57-HCV质粒，含有HIV1正向和反向引物扩增的目的序列的pUC57-HIV1质粒，含有RV正向和反向引物扩增的目的序列的pUC57-RV质粒；上述的HCV、HIV1或RV的引物、荧光探针与阳性工作标准品序列如下：

HCV：

正向HCV引物：CTCCCGGGAGAGCCATAGT

反向HCV引物：CAAGCACCCTATCAGGCAGTA

HCV荧光探针序列：FAM+CGGAACCGGTGAGTACACCGGA+TAMRA

HCV扩增片段长度为182bp；

HCV阳性工作标准品的目的序列为：

ttagtatgagtgtcgtgcagcctccaggaccccccctcccgggagagccatagtggtctgcggaaccggtgag

tacaccggaattgccaggacgaccgggtcctttcttggataaacccgctcaatgcctggagatttgggcgtgccc

ccgcaagactgctagccgagtagtgttgggtcgcgaaaggccttgtggtactgcctgatagggtgcttgcgagt

gccccgggaggtctcgta

HCV阳性工作标准品的目的基因的片段长度为240bp；

HIV1：

正向HIV1引物：CCGGCCATAAGGCAAGAGT

反向HIV1引物：TCTCTGCATCATTATGGTAGCTGAA

HIV1荧光探针序列：

FAM+TGGCTGAAGCAATGAGCCAAGTAAC+TAMRA

HIV1扩增片段长度为74bp；

HIV1阳性工作标准品的目的序列为：

attgtaagactattttaaaagcattgggaccagcggctacactagaagaaatgatgacagcatgtcagggagtag

gaggacccggccataaggcaagagttttggctgaagcaatgagccaagtaacaaattcagctaccataatgatg

cagagaggcaattttaggaaccaaagaaagattgttaagtgtttcaattgtggcaaagaagggcacacagccag

aaattgcagggccccta

HIV1阳性工作标准品的目的基因的片段长度为240bp；

RV：

正向RV引物：CAGATCCCTAAATGCAACGGTTA

反向RV引物：CCCAGATAGCCCCCTAGAACA

RV荧光探针序列：FAM+TGCTGCATGTGCTCCTCATGA+TAMRA

RV扩增片段长度为72bp；

RV阳性工作标准品的目的序列为：

atctccttattcatcaaatgctgttggtcacgtgttcaatctcattcactttgtaggatgctatatgggtcaagtcagat

ccctaaatgcaacggttattgctgcatgtgctcctcatgaaatgtctgttctagggggctatctgggagaggaattc

ttcgggaaagggacatttgaaagaagattcttcagagatgagaaagaacttcaagaatacgaggcggctgaact

gacaaagac

RV阳性工作标准品的目的基因的片段长度为240bp。

2.权利要求1的试剂盒应用于临床眼库供体少量结膜组织标本HCV、HIV1和RV的检测。

3.检测试剂盒对眼库供体HCV、HIV1或RV RNA进行检测的方法：

(1)供体眼球结膜组织总RNA的提取和阳性工作标准品的构建：取5mg供体眼球结膜组织，将组织块放入离心管中，应用RNA提取试剂提取组织总RNA，分别作为模板用于下面的扩增；

(2)HCV、HIV1或RV RNA的逆转录和扩增：

分别在三组反应管中加入下列组分体系：

2X反转录PCR预混试剂：                     10μL

Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)：                 0.8μL

反转录酶：                                0.28μL

正向HCV、HIV1或RV引物(5pmol/μL)：        1μL

反向HCV、HIV1或RV引物(5pmol/μL)：        1μL

HCV、HIV1或RV荧光探针(5pmol/μL)：        0.8μL

RNA模板：                                 5pg-50ng

无核酸酶的蒸馏水：                        至20μL

其中HCV组RNA模板为10⁸-10¹拷贝/μL倍比稀释的HCV阳性工作标准品和从供体眼球的结膜组织提取的RNA；HIV1组RNA模板为10⁸-10¹拷贝/μL倍比稀释的HIV1阳性工作标准品和从供体眼球的结膜组织提取的RNA；RV组RNA模板为10⁸-10¹拷贝/μL倍比稀释的RV阳性工作标准品和从供体眼球的结膜组织提取的RNA；每个模板设立三个复孔，混匀离心后进行反转录和扩增反应，具体程序如下：

当供体眼球的结膜组织的RNA与阳性工作标准品同时进行反应后，制作出标准曲线，再将供体眼球的结膜组织的RNA扩增曲线得到的Ct值代入标准曲线，就可以得到供体眼球的结膜组织的HCV、HIV1或RV的拷贝数，从而确定供体角膜组织内是否感染致病病原体HCV、HIV1或RV及其数量。