[发明专利]与猪免疫性状相关的小RNA分子标记与应用

说明书

技术领域

本发明属于家畜分子标记技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择的与免疫性状相关的小RNA分子标记的克隆及应用。

背景技术

miRNA(microRNA)是近年来发现的一类对生物生命活动起重要调控作用的小分子非编码RNA，长度约为22nt，广泛存在于动、植物体中(Bartel，2004)。通过与靶mRNA特异性的碱基配对结合引起靶mRNA的降解或者对其翻译过程进行抑制，从而实现对基因转录后水平的调控。RNA科技的第二次革命，为人们提供了一种全新的角度来认识基因及其表达调节的本质，促使生物学家重新思考和探索遗传信息的表达调控问题(姚成果和金由辛，2004)。许多研究表明miRNA调控方式参与了生物体生长、发育，免疫调节及疾病发生等生物学过程(龙茹等，2007)。对miRNA的深入研究，势必有利于我们对生物体生长、发育过程，致病机制的理解，并为动植物的育种和疾病的诊断、治疗提供理论基础。

miRNA与免疫系统的关系研究正在如火如荼地进行。目前对参与免疫调节的miRNAs只有miR-146和miR-155研究得较为清楚。Taganov等(Taganov等，2006)对miR-146参与的免疫调节进行了深入研究，发现在人的单核细胞中miR-146a/b，miR-132，miR-155等是内毒素响应基因，能被一系列细菌组分及前炎症细胞因子诱导产生。启动子分析表明miR-146a是NF-kB依赖型基因。证实了TNF受体相关因子6和IL-1受体相关激酶1基因是miR-146a/b的靶基因(Taganov et al.，2006)。对miR-155的研究显示其参与免疫系统的调节作用，O’Connell等(2007)在用聚肌胞(Poly I：C)和IFN-β刺激鼠源性巨噬细胞后，利用基因芯片检测miR-155差异表达，发现其是唯一受这两种因子刺激后持续上调表达的miRNA。通过药理学方式抑制激酶JNK能阻止Poly I：C或IFN-β诱导miR-155的生成，表明JNK通路调控诱导miR-155产生的信号(O’Connell et al.，2007)。

由于对血细胞分化发育有影响的miRNA可能调节T细胞或B细胞发育，所以它们可能直接或间接参与了机体的免疫调节。目前对造血系统miRNAs的研究较为广泛，发现了一批与血细胞分化发育有关的miRNAs，但许多miRNAs停留在表达水平检测上。例如鼠miR-181在B淋巴细胞中高表达，miR-142在B淋巴细胞和髓系细胞中高表达，miR-223在髓系中高表达。miR-181在鼠骨髓造血干细胞中中等程度表达，随着向B系分化的过程明显增加，而在向其他链系分化过程中没有变化。这些提示miR-181可能在血细胞分化过程中起着重要作用(杨桂花等，2007)。目前对胸腺T淋巴细胞的分子发育机制的研究主要集中于蛋白编码基因及相关的转录因子信号通路上，有关miRNA方面的研究较少，还尚未大规模展开。Neilson等(2007)通过小RNA的cDNA文库克隆检测了小鼠不同发育阶段胸腺T淋巴细胞(DN1、DN3、DN4、DP、CD4、CD8)中miRNAs的动态表达规律，结果显示T细胞的发育受一系列miRNAs协调控制，miR-29c在胸腺T淋巴细胞DN1期呈显著下调表达(Neilson et al.，2007)。

有研究显示，高含量miR-29c和miR-181可抑制TCL1原癌基因(引发最具侵略性的白血病)的表达，miR-29c、miR-181的表达与TCL1原癌基因的表达呈反比关系(Pekarsky et al.，2006)；Fabbri等(2007)。研究发现miR-29家族在肺癌中呈下调表达，并验证了DNA甲基转移酶3a和3b是miR-29的靶基因(Fabbriet al.，2007)；Mott等(2007)验证抗凋亡Bcl-2家族一员的Mcl-1是miR-29b的靶基因(Mott et al.，2007)。因此我们推测该miR-29家族可能抑制T细胞的发育分化。

对miR-29c靶基因进行了预测和筛选，发现了几个参与T细胞发育活化的重要靶基因，主要有ICOS和NFATc4基因等。ICOS基因主要作用是活化T细胞，能增强所有基本的T细胞对外来抗原的反应。NFATc4基因，是T淋巴细胞受抗原刺激后产生细胞因子(如IL-2)所需的转录因子，在免疫应答期对细胞因子基因转录调控起重要作用。NFAT不仅在完全分化的T细胞中调节细胞基因的表达，而且在T细胞分化过程中也起着重要作用。因此我们推测miR-29c可能抑制这些与T细胞活化直接相关基因的表达来调节T细胞发育活化的。