[发明专利]基于生物小RNA的分子标记的方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术与基因工程领域，涉及一种基于生物小RNA序列的分子标记新技术。 该技术适用于动植物、微生物等生物标记开发，且是一种基于PCR和基因表达序列的高通 量功能标记。

背景技术

自从Botsein等人在1980年为构建人类遗传图谱首次使用分子标记技术，即限制性片 段长度多态性(RFLP)以来，人们已经开发出了各种不同的分子标记来进行DNA多态性的 检测。分子标记技术主要可分为两大类：基于PCR技术和非基于PCR技术(如RFLP)。基于 PCR技术的分子标记又可进一步分为两类，即基于随机引物技术(如扩增性片段长度多态性， AFLP和随机扩增多态性DNA，RAPD)和基于目标序列的PCR技术(Agarwal et al.Plant Cell Rep 2008，27：617-631)。在目标序列这一类型中，除了基于微卫星技术(如简单序列重 复，SSR)和单核苷酸多态性(SNP)技术，基于转座元件的分子标记也得到了很好的开发。 这种标记是根据那些大量且广泛分布于基因组中的一小段保守序列(如LTR)来进行引物设 计的。例如，逆转录转座子间长度多态性(IRAP)(Waugh et al.Mol Gen Genet 1997， 253：687-694；Kalendar et al.Theo Appl Genet 1999，98：704-711)和MITE间长度多 态性(IMP)(Chang et al.Theo Appl Genet 2001，102：773-781)。利用MITE(微反向 重复转座因子)中逆转录转座子的长末端重复(LTR)和末端反向重复(TIR)来进行引物 设计，在几种作物(如大麦)中都得到了很好的应用。

内源性非编码小RNA(通常21-24个核苷酸)在植物基因转录后调控方面发挥重要作 用。总体上，基于小RNA合成机理和功能(Bartel Cell 2004，116(2)：281-297)来说， 小RNA主要可分为两种，即微小RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)。最近研究(Taft et al.Nature Genetics 2009，41：572-578)发现一种新类型的RNA，即转录起始RNA(tiRNA)， 是位于转录起始点上游60个核苷酸和下游120个核苷酸片段上的长度大多为18个核苷酸 的一种RNA，具有调控功能。通过高通量测序途径可以获得18-35个核苷酸长度的小RNA 序列。小RNA序列通常是保守的，例如miRNA，但小RNA两翼序列多态性是很高的，很多 结构性差异(如插入或缺失)(如在水稻上，Wang et al.BMC Evol Biol，2010，in press)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种基于生物小RNA的分子标记的方法。为解决该 技术问题，本发明中的基于生物小RNA的分子标记的方法，包括以下步骤：

(1)小RNA序列数据的获得

提取生物总RNA，然后根据序列长度进行分离，对其中序列长度小于35nt的RNA样品 进行测序，以得到长度在15～35nt之间小RNA序列；

(2)小RNA序列基因组定位

将前述小RNA定位到相应基因组上，获得每个特异小RNA在基因组定位位点的数量和 与其两端相连序列的数据；

(3)PCR引物设计

根据在基因组中特异定位位点数量超过1000个的一批小RNA及其两端相连序列设计 PCR引物，并通过组合获得引物对，然后通过ePCR进行引物对的筛选；

(4)PCR扩增及其遗传多态性检测

根据上步获得的引物对，进行遗传作图群体或遗传多态性群体PCR扩增和多态性条带 的确定，PCR产物的检测通过普通变性胶或非变性胶检测，或者通过同位素标记技术标记 方式进行检测，以提供检测精度和该标记开发的效率。

本发明中，步骤(1)中所述的测序是高通量测序。

本发明中，针对扩增条带过多的情况，在引物设计中增加l～2个随机碱基接头。

本发明的有益效果是：