[发明专利]一种介孔二氧化钛固定化酶及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种固定化酶及其制备方法和应用。

背景技术

无毒无害环境的二氧化钛材料是近年来备受关注的一种新型材料，它作为理想的含钛活性载体具有广阔的前景。介孔二氧化钛(M-TiO₂)具有比表面积大，化学稳定性强，机械操作强度好等优良特性，因此开发生产M-TiO₂介孔材料及以该材料为载体的固定化酶产品是很有意义的。

γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2)可特异性地将γ-谷氨酰基转移至受体分子，得到新的含γ-谷氨酰基的化合物，该反应成为谷氨酰基化反应。通过改变受体种类可获得不同的谷氨酰化合物，如催化合成药物或药物的前体，如L-γ-谷氨酰-L-多巴，它是帕金森综合症的前体药物；谷胱甘肽，其在临床上用于肝病的辅助治疗、有机物及重金属的戒毒等。由于其催化的过程位点特异性和光学选择性强，无需对反应物进行保护和脱保护，反应过程中也不消耗ATP。因此，利用该反应制备系列γ-谷氨酰基类化合物的研究正在成为工业生物催化领域的研究热点。目前，对γ-谷氨酰转肽酶的应用研究均以游离酶为催化剂，针对其的固定化方法及其性质研究未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种介孔二氧化钛固定化酶，以进一步提高γ-谷氨酰转肽酶的使用效率，降低制备谷氨酰化合物的工艺成本。

本发明还要解决的技术问题是提供上述介孔二氧化钛固定化酶的制备方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述介孔二氧化钛固定化酶的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种介孔二氧化钛固定化酶，它包括酶和固定所述酶的载体，所述的酶为γ-谷氨酰转肽酶，所述的载体为介孔二氧化钛。

其中，所述的介孔二氧化钛为宽度100～300nm、长度1～10μm的棒状颗粒，颗粒上的微孔直径为20～50nm，比表面积可达30～80m²/g。

本发明所述的介孔二氧化钛(M-TiO₂)具有很好的化学稳定性，可耐受pH 0～14，且结构稳定，有很好的机械操作强度，M-TiO₂表面主要是羟基，极易与酶分子发生氢键吸附发应。

上述介孔二氧化钛固定化酶的制备方法，将介孔二氧化钛浸泡于pH7.0～9.0的30～60mmol/L Tris-HCl缓冲液中10～50h，抽干，加入浓度为0.010～0.127mg/mL的γ-谷氨酰转肽酶溶液，于4～45℃下振荡反应1～6h后，将液体滤出，固体颗粒用pH7.0～9.0的30～60mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗2～3次，即制得介孔二氧化钛固定化酶。

优选的制备方法是：将介孔二氧化钛浸泡于pH8.0的50mmol/L Tris-HCl缓冲液中24h，抽干，加入浓度为0.015～0.075mg/mL的γ-谷氨酰转肽酶溶液，于4℃下振荡反应2.5h后，将液体滤出，固体颗粒用pH8.0的50mmol/LTris-HCl缓冲液反复清洗2～3次，即制得介孔二氧化钛固定化酶。

其中，将介孔二氧化钛浸泡于pH7.0～9.0的30～60mmol/L Tris-HCl缓冲液中10～50h，对于每g介孔二氧化钛，Tris-HCl缓冲液的使用体积为30～100mL，优选使用体积为50mL。

其中，对于每g湿质量的介孔二氧化钛，γ-谷氨酰转肽酶溶液的加入体积为8～20mL，优选加入体积为10mL。

通过本发明方法制备得到的介孔二氧化钛固定化酶在pH7.0～9.0的30～60mmol/LTris-HCl缓冲液中保存。

通过本发明方法制备得到的介孔二氧化钛固定化酶可用于催化制备系列γ-谷氨酰基化合物。

有益效果：本发明充分利用M-TiO₂这一固定化酶载体的良好特性，特别是形状均一、机械强度高、良好的结合性能等，通过氢键吸附法固定化γ-谷氨酰转肽酶，从而为发明M-TiO₂固定化γ-谷氨酰转肽酶提供了良好的前提条件。通过本发明方法制备的M-TiO₂固定化γ-谷氨酰转肽酶形状均一，酶活力回收率平均达到54.0％；与游离酶相比，固定化酶的最适作用pH和温度略有改变，且适用pH和温度范围均有一定程度的扩大，固定化酶的温度及pH稳定性均较游离酶有大幅度提高，且重复使用性能好。

附图说明