[发明专利]HMO合成

说明书

本发明涉及稳定地培养于培养基中的适应于制备寡糖的细胞，转化所述细胞使其包含至少一个编码参与寡糖合成的酶的核酸序列。

例如从Dumon等(2001)已知这种细胞。

长时间来已知人母乳，除乳糖外，还包含被称为人乳寡糖(HMO)的寡糖的复杂混合物。就组成和量而言此人母乳的寡糖部分是独特的。与其他哺乳动物形成对比，人母乳包含7～12g/L的寡糖浓度，其比在大多数其他哺乳动物中高10～100倍(Boehm和Stahl，2007，Kunz等，2000，Newburg和Neubauer，1995)。

现在，属于HMO的超过80种化合物已经在结构上被表征。通常，与在人体中发现的其他寡糖不同，HMO的特征在于，在还原末端的乳糖结构部分，和在非还原末端的岩藻糖和/或唾液酸。

区分有两种基本类型：I型结构的寡糖具有与GlcNAc进行α1，4-连接的岩藻糖，而II型结构的寡糖显示GlcNAc或葡萄糖的α1，3位岩藻糖基化；任何一种类型可以包含与半乳糖进行α1，2-连接的岩藻糖。最重要的寡糖是2′-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖。

这些结构与上皮细胞表面复合糖的表位、Lewis组织-血型抗原诸如Lewis x(Le^x)(Gal(β1-4)[Fuc-(α1-3)]GlcNAc(β1))密切相关(Newburg，2001)。HMO与上皮表位的结构同源性解释了防御细菌性病原体的性质。

例如，通过使病原体与HMO而非与人黏膜表面聚糖结合能够显著减小致病大肠杆菌(Escherichia coli)(Cravioto等，1991)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)(Coppa等，2006)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(Andersson等，1986)或空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(Ruiz-Palacios等，2003)的毒力，并且与毒素如大肠杆菌(E.coli)的热稳定肠毒素的结合也是如此(Crane等，1994)。

除了所提及的在肠道中的局部作用，HMO通过进入全身循环，还能够在婴儿中诱发全身作用(Gnoth等，2001)。HMO对蛋白-碳水化合物相互作用，例如选择蛋白-白细胞结合的影响能够调节免疫反应并且减小炎性反应(Bode，2006，Kunz和Rudloff，2006)。

为降低新生儿获得感染的频率并且，因此，以及婴儿死亡率，当然非常需要广泛地给婴儿提供包括HMO的营养物。这在其中普遍并且广泛实行母乳喂养的社会中可能是容易实现的。但是一般都不是这样。

存在若干医学原因，比如可能的传染性疾病的母婴传播，所述原因在特定情况下反对母乳喂养。在很多非洲国家，例如，母乳喂养可能是在婴儿期期间感染HIV的主要原因。

同样地，文化情况可能导致拒绝母乳喂养，如在主要工业国家像，例如，美国就是这样。

由于HMO在天然源诸如其他哺乳动物的乳汁中只能以低浓度存在，所以从天然源提取寡糖不适于满足对HMO的需要。

寡糖的化学合成是费力的并且需要多个保护和脱保护步骤(Kretzschmar和Stahl，1998)，因此通常相对昂贵并且具有低的回收率。

因此，利用生物技术工程生物体发酵制备寡糖对于大规模的HMO合成是有前途的可选解决方案。

在过去的十年中，若干合成HMO的成功尝试已被发表，所述尝试使用重组大肠杆菌发酵或使用体外酶转化。这些尝试主要集中在合成属于HMO或与HMO十分相似的岩藻糖基化的化合物。

例如，若干出版物描述了以下各项的合成：Lewis结构乳-N-新岩藻戊糖(lacto-N-neofucopentaose)、乳-N-新二岩藻己糖(lacto-N-neodifucohexaose)和乳-N-新二岩藻辛糖(lacto-N-neodifucooctaose)，以及2′-和3-岩藻糖基乳糖(fucosyllactose)(Albermann等，2001，Dumon等，2006，Dumon等，2001，Dumon等，2004，Koizumi等，2000)。在这些情况中，离析物像例如乳糖的酶岩藻糖基化通过岩藻糖基转移酶(FucTs)来进行。

报道岩藻糖基化的化合物制备的多数出版物就此描述了源自幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的FucTs的使用。一般，人FucTs也能够用于此目的。然而，当在细菌细胞中超表达时，来源于细菌的FucTs一般较少地倾向于产生诸如错折叠和不溶性的问题。