[发明专利]人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化

说明书

本发明要求于2008年10月31日提交的序列号为61/110,278的申请的 优先权。

技术领域

本发明提供了促进多能干细胞分化的方法。具体地讲，本发明提供了一 种增加与胰腺内分泌谱系相关的标记物表达的方法。

背景技术

用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注 意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种 方法是从多能干细胞，例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。

在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产 生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群体。诸如甲状腺、胸 腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过 程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标记物，例 如HNF-3β、GATA4、Mixl1、CXCR4和Sox-17。

定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰- 十二指肠同源盒基因Pdx1。在不存在Pdx1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后 不再发育。因而，Pdx1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其 他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌 组织来自胰腺内胚层的分化。

据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生了带有胰岛细胞特征的细胞。例如， Lumelsky等人(Science 292：1389，2001)报道了小鼠胚胎干细胞向类似胰岛的 胰岛素分泌结构的分化。Soria等人(Diabetes 49：157，2000)报道，衍生自小鼠 胚胎干细胞的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠中的血糖变 正常。

例如，Hori等人(PNAS 99：16105，2002)揭示，用磷酸肌醇3-激酶 (LY294002)的抑制剂处理小鼠胚胎干细胞产生了类似β细胞的细胞。

又如，Blyszczuk等人(PNAS 100：998，2003)报道，从组成型表达Pax4 的小鼠胚胎干细胞产生了胰岛素生成细胞。

Micallef等人报道说，视黄酸可调节胚胎干细胞定向形成Pdx1阳性胰 腺内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末的期间，加入胚胎干细胞分化第4 天的培养物中时视黄酸是诱导Pdx1最有效的(Diabetes 54：301，2005)。

Miyazaki等人报道了过表达Pdx1的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果显 示，外源Pdx1表达在所得的分化细胞中明显增强了胰岛素、生长抑素、葡 萄糖激酶、神经元素3、P48、Pax6和HNF6基因的表达(Diabetes 53：1030， 2004)。

Skoudy等人报道说，激活素A(TGF-β超家族的成员)能上调小鼠胚 胎干细胞中的胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdx1、胰岛 素和胰高血糖素)的表达。使用1nM激活素A时观察到最大的效果。他们 还观察到，胰岛素和Pdx1 mRNA的表达水平不受视黄酸的影响；然而，3nM FGF7处理导致Pdx1的转录水平升高(Biochem.J.379：749，2004)。

Shiraki等人研究了能特征性增强胚胎干细胞分化成Pdx1阳性细胞的生 长因子的效果。他们观察到，TGF-β2可再现地产生更高比例的Pdx1阳性细 胞(Genes Cells.2005年6月；10(6)：503-16)。

Gordon等人阐明了在不存在血清的情况下和在存在激活素连同Wnt信 号转导抑制剂的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导brachyury⁺/HNF-3β⁺内胚层细 胞(US 2006/0003446A1)。

Gordon等人(PNAS，第103卷，第16806页，2006年)声称：“Wnt 和TGF-β/nodal/激活素信号转导同时为前原条的产生所必需”。

然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物(例 如人)中的发育程序。

Thomson等人从人胚泡分离了胚胎干细胞(Science 282：114，1998)。同 时，Gearhart和其同事从胎儿生殖腺组织衍生了人胚胎生殖(hEG)细胞系 (Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998)。与可简单通 过与白血病抑制因子(LIF)一起培养来防止分化的小鼠胚胎干细胞不一样，人 胚胎干细胞必须维持在非常特殊的条件下(美国专利No.6,200,806、WO 99/20741、WO 01/51616)。