[发明专利]使用包含特异性配体的亲和树脂的抗体纯化方法

说明书

发明领域

本发明涉及用于抗体，例如单克隆抗体的新的纯化方法。所述方法利用包含在其上固定有一个或多个低分子量合成配体的固相材料的亲和树脂。所述亲和树脂能够从非常密切相关的蛋白质中分离出抗体。

发明背景

近年来，单克隆抗体(mAb)已经成为许多大型生物技术公司的主要焦点。将mAb作为生物药物进行测试，用于治疗各种疾病，尤其是免疫和自身免疫性疾病以及癌症。因为未来市场上mAb药物数量预期有极大地增加，因此对降低生产成本的需要也随之增加。在目前的生产中，mAb生产的纯化步骤占生产成本的大约70％。

目前可通过各种方法从发酵上清液中纯化抗体，所述方法例如常规色谱、具有蛋白质配体或小分子配体的亲和色谱。

涉及多步骤的常规色谱有以下一个或多个缺陷：总收率低、缓冲液消耗高、工艺时间长和工艺设备投资大、人工成本增加。

具有蛋白质配体的亲和树脂导致收率较高、缓冲液消耗较低和工艺设备投资较低。然而，与小合成配体相比，具有蛋白质配体的亲和树脂的生产成本非常昂贵而且化学和构象稳定性较差，并且具有纯化抗体被来自蛋白质配体的蛋白质片段或来自具有蛋白质配体的亲和树脂的生产中的其它生物材料污染的危险。

US 6,117,996公开了具有以下通式的包含配体的亲和配体-基质缀合物：

所述配体连接在支持基质的位置(A)上，任选通过插入基质与配体之间的间隔臂。也公开了使用这类亲和配体-基质缀合物，来纯化蛋白质材料例如胰岛素、因子VII、人生长激素或类似物、抗体例如免疫球蛋白、其衍生物和片段以及前体的方法。

US 6,498,236公开了具有以下通式的亲和配体用于免疫球蛋白的纯化：

(H₂N-X₁-Thr-X₂-CO)n-R。

WO 2006/066598公开了包含一个或多个疏水性官能团和一个或多个阳离子官能团的亲和配体用于单克隆抗体的纯化。

US 6,207,807公开了用于纯化免疫球蛋白的三肽亲和配体。从组合文库扫描中鉴定了四聚体三肽(Arg-Thr-Tyr)₄(参考：Fassina等.JOURNAL OF MOLECULAR RECOGNITION，VOL.9，564-569(1996))，所得到的亲和树脂用于从血清中分离免疫球蛋白。为了改善稳定性，制备了多聚体三肽的所有D-氨基酸形式并用于单克隆抗体的纯化(参考：Fassina等，Journal of Immunological Methods 333(2008)126-138)。

D’Agostino等[(2008)；Affinity purification of IgG monoclonal antibodies using the D-PAM synthetic ligand：Chromatographic comparison with protein A and thermodynamic investigation of the D-PAM/IgG interaction(用D-PAM合成配体亲和纯化IgG单克隆抗体：与蛋白A的色谱对比和热动力学考察D-PAM/IgG相互作用).Journal of Immunological Methods，第333卷，第1-2期，第126-138页]仅描述了多聚体分子用于抗体的纯化。其中结合种类(例如线形三肽Arg-Thr-Tyr)与三赖氨酸支架偶联，以产生对抗体具有增加的亲合力的多价配体。然而，三赖氨酸核心支架不与抗体相互作用。

的确，涵盖小分子亲和树脂的现有技术是克服了蛋白质配体亲和树脂的部分缺陷。然而，仍然需要用于抗体纯化的新方法和材料，尤其是需要比现有技术公开的那些更便宜、基质更稳定(more base stable)和更具选择性的亲和树脂。此外，需要能允许不影响靶蛋白活性的温和洗脱条件的树脂。

发明概述

本发明涉及提供亲和树脂，所述树脂包含对抗体、尤其是单克隆抗体具有选择性的新的合成亲和配体，并且不以蛋白质配体为基础，同时又是便宜和基质稳定的。

附图简述

图1.三聚配体(A)和四聚配体(B)的通用结构的示意图。

图2.在最初的两个主成分中的229,957个虚拟配体结构的主成分图。数据点按照支架而着色，黑方块是用于文库设计的28个先前已鉴定的结合物(WO 2006/066598)。