[发明专利]RNA合成－用于反向合成RNA的亚磷酰胺，以及在3’-末端合成RNA的配体、发色团和修饰物的方便引入中的应用

说明书

相关申请

本申请要求于2008年9月6日提交的第61/191,065号美国临时申请的权益。上述申请所教导的全部内容引入本文作为参考。 

发明领域

本发明涉及新RNA单体亚磷酰胺的合成，以及相应的适用于RNA寡核苷酸在5’→3’反向上合成的新方法的固体载体。本方法导致非常清洁的寡核苷酸的合成，并使得能在3’-末端清洁地且有效地引入不同的修饰，从而产生高纯度治疗级的RNA寡核苷酸。 

发明背景

确定序列的RNA在3’→5’方向上的合成现在是成熟的，并当前用于多种治疗级RNA适体、tRNA、siRNA和生物上有活性的RNA的合成和开发中。本方法使用具有合适的N-保护基的核苷：一般是5’-保护基，最常见的是二甲氧基三苯基，即DMT基团；2’-保护基，其中最常见的是叔丁基二甲基甲硅烷基醚；以及，3’-亚磷酰胺，其中最常见的是氰乙基二异丙基(组分1)。随后将该组分与带有适当的N-保护基的核苷，结合到固体载体上的核苷的2’或3’琥珀酸酯偶联(组分2)。在活化剂的存在下，在溶液相中也实现了组分1和5’-OH-正-保护的-2’，3’-保护的-核苷(组分3)的偶联，所述活化剂导致二聚和寡聚核苷酸的形成，随后氧化(3’→5’方向的合成)，也导致了具有3’-5’-核苷酸间连接体的保护二聚核苷的形成，Ogilvie，K.K.，Can.J.Chem.，58，2686，1980(方案1)。 

然而，据我们所知，尚未实现在反向(5’-3’方向)上的RNA合成。 

已经广泛地开发了组分1的2’-甲硅烷基醚，并且发现其具有不同寻常的稳定性。广泛地研究了甲硅烷基醚的溶剂分解作用，并已知大(bulky)的烷基甲硅烷基醚具有高度的稳定性；Bazani，B和Chvalowski，V Chemistry  of Organosilicon compounds，第1卷，Academic Press，New York，1965。随后，Ogilvie及其同事关于将2’-羟基保护基用于寡核苷酸的合成完成了大量的研究工作(Ogilvie，K.K.，Sadana，K.L，Thompson，E.A.，Quilliam，M.A.，and Westmore，J.B TetrahedronLe Letters，15，2861-2864，1974；Ogilvie，K.K.，Beaucage，S.L，Entwistle，D.W.，Thompson，E.A.，Quilliam，M.A.，and Westmore，J.B.J.Carbohydrate Nucleosides Nucleotides，3，197-227，1976；Ogilvie，K.K.Proceedings of the 5th International Round Table on Nucleosides，Nucleotides and Their Biological Applications，Rideout，J.L.，Henry，D.W.，和Beacham L.M.，III，eds.，Academic，London，第209-256页，1983)。