[发明专利]具有提高的稳定性的经修饰的β-糖苷酶

说明书

技术领域

该发明涉及经修饰的里氏木霉(Trichoderma reesei)β-糖苷酶。本发明更具体地涉及具有提高的稳定性的经修饰的里氏木霉β-糖苷酶。本发明还涉及包含编码经修饰的β-糖苷酶的核苷酸序列的基因构建体、用于从宿主菌株中生产经修饰的β-糖苷酶的方法，以及经修饰的β-糖苷酶用于水解纤维素和化合物生产(如用于医药和食品工业中的那些化合物)的用途。

背景技术

β-糖苷酶包括糖基水解酶家族1和3的成员，所述成员的基本酶功能是水解纤维二糖或可溶性纤维糊精中连接糖残基的β-糖苷键。一些β-糖苷酶对纤维二糖或芳基糖苷是特异的，这些被表征的β-糖苷酶中的大部分具有较宽的特异性并且可以水解多种底物(Bhatia et al，2002)。在一些条件下，这些酶还可以通过逆反应或通过转糖基作用催化糖苷键的合成(Sinnott，1990)。该类酶的水解和合成能力可用于生物技术应用。

β-糖苷酶的水解活性的一个主要应用是减轻纤维素酶系统的产物抑制。纤维二糖——纤维素水解的主要产物——强烈地抑制纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)的活性。加入足量的β-糖苷酶以水解纤维二糖成为葡萄糖，葡萄糖抑制性减弱，使得在较高程度的底物转化基础上获得显著的活性增长(US 6,015,703)。

Bhatia等(2002)已经综述了β-糖苷酶的很多其他生物技术应用。依赖于其水解活性的应用实例包括医药上重要的化合物从类黄酮和异类黄酮(isoflavanoid)糖苷中释放，和果汁和酒中芳香化合物的释放(US 6,087,131)。合成活性的典型用途是生产用作去污剂的烷基-糖苷(Ducret et al.，2002)。

糖基水解酶——包括β-糖苷酶——的活性依赖于所述酶的活性位点中催化氨基酸(谷氨酸或天冬氨酸)具体的质子化状态，所述状态受到pH影响。例如，来自里氏木霉的β-糖苷酶I在5.0-5.5的pH范围内最活跃，但在更酸性或者更碱性的条件下活性急剧下降(Woodward and Arnold，1981)。

蛋白质活性和稳定性的pH依赖性不一定有关系。酸性或碱性条件的去稳定作用是由于氨基酸侧链的质子化或去质子化，所述氨基酸侧链可能不是催化性的或者甚至不在活性位点附近。pH依赖的变性主要是由于天然和变性状态下特定氨基酸侧链的不同pK_a值，这将pH依赖性引入状态间的自由能差异。此外，蛋白质在极端pH下可以变得高度荷电并且分子间静电排斥增强(Fersht，1998)。

pH最适值改变的工程酶在新的pH下不一定能长时间稳定。已使一些糖苷水解酶发生突变以改变它们在对工业应用重要的pH值下的活性或稳定性。对于淀粉加工应用，对来自地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)的α-淀粉酶进行工程改造以包括两个氨基酸替换，M15T和N188S，这将其低pH(5.2)活性增加至野生型的140％(美国专利No.5,958,739)。第三个突变H133Y的加入进一步将活性增加至所述双突变体的150％以上。由合理设计方法鉴定到，杆菌内切葡聚糖酶中一个环的替换将其pH最适值转变以用于纺织品应用。用Ala-Gly-Ala替换，pH最适值上移了超过1个pH单位(美国公开文本No.2005/0287656)。另外一个实例是将氨基酸替换A162P和W62E纳入特异腐质霉(Humicola insolens)的Cel45内切葡聚糖酶。这些突变将碱性条件(pH 10)下的活性增加至野生型的124-144％(美国专利No.5,792,641)。最后一个实例，通过加入替换N10H、N11D、Y27M和N29L的多种组合显著提高了重组木霉木聚糖酶在超过5.5的pH下的活性(US 5,866,408)。