[发明专利]小型振荡瓶培养

说明书

本文报道了小型振荡瓶培养哺乳动物细胞的方法，其中振荡瓶内部培养基的条件通过振荡瓶的旋转速度和振荡瓶的外部气压来控制。

发明背景

在开发例用哺乳动物细胞来生产重组多肽的生物技术生产工艺的过程中，有多个参数需要进行调节和优化。由于需要大量的单独实验，这种优化以小规模进行，优选在振荡瓶中进行。但由于大型搅拌培养器和小型振荡瓶在几何尺寸和反应条件上的差异，得到的小规模的结果不代表大型工艺的真实结果。这些差异是由化学、生化和加工工程的原因引起的。

因此，总体目标是找出小型和大型工艺的条件例如细胞密度、产品浓度或尽可能好的产品质量之间的联系。为了使大型工艺和小型工艺尽可能具有可比性，必须评估各种差异对获得的结果的影响。例如，如果大型工艺是搅拌工艺，那么小型工艺最好也采用搅拌工艺。

DE4415444报道了振荡瓶中摄氧速率在线测定的自动测定系统。Kensy F.等人(Biotechnol.Bioeng.89(2005)698-708)报道了48孔微量滴定板的氧传递现象。Nowack G.等人(Am.Physio.Soc.(1996)C2072-C2080)报道了L-抗坏血酸调节肾细胞的生长与新陈代谢。Randers-Eichhorn L.等人(Biotechnol.Bioeng.51(1996)466-477)报道了在组织培养瓶中的非侵入性氧测量和传质考虑因素。Micheletti M.等人(Chem.Eng.Sci.61(2006)2939-2949)报道了振荡生物反应器中的流体混合：对于微量型微生物和哺乳动物细胞培养规模扩大化预测的意义。

因此，需要在小型振荡瓶基础上设计大型搅拌哺乳动物细胞培养工艺，反之亦然。另一个目标是提供小型振荡瓶工艺，在其中实现培养基搅动和混合的小型机械搅拌。

发明概述

本发明的第一个方面是培养哺乳动物细胞的方法，包括：

-根据如下因素调节培养容器的机械运动速度：

i)培养基中的活细胞密度，和/或

ii)培养基中的氧分压。

在一个实施方式中，该方法包括一个或多个以下步骤：

a)培养一套培养容器

-每一个容器的总容积最高为200μl，或

-每一个容器的工作容积最高为100μl，或

-每一个容器的总容积在25ml至3000ml之间，或

-每一个容器的工作容积在10ml至1500ml之间，和/或

b)通过整个培养容器的机械运动来搅动培养基，

c)通过培养容器的外气相的二氧化碳浓度来调节培养基的pH值。

在一个实施方式中，培养容器包含培养基和培养基上方的内部气相。在另一个实施方式中，培养容器包含将内部气相和外部气相分离的膜或帽或盖。在本发明方法的一个实施方式中，机械运动通过整个培养容器的旋转运动或整个培养容器的俯仰运动或整个培养容器的振荡来实现。

在进一步的实施方式中，本发明的方法还包括：

d)通过非侵入性光化学传感器确定培养容器内的pH值和pO₂。

在另一个实施方式中，机械运动速度的调节如下：

i)根据起始细胞密度将机械运动速度设置为60rpm至100rpm，其中

当细胞密度为1x10⁵细胞/ml或更小时设置为60rpm，

当细胞密度为2.5x10⁵细胞/ml时设置为80rpm，

当细胞密度为5x10⁵细胞/ml时设置为100rpm，

或在中间细胞密度时设置为线性中间值，

ii)活细胞密度每增加一倍，机械运动速度增加20rpm，直至细胞浓度达到20x10⁵细胞/ml，

iii)活细胞密度每增加20x10⁵细胞/ml，机械运动速度增加20rpm，直至细胞密度达到80x10⁵细胞/ml，

iv)活细胞密度由80x10⁵细胞/ml增加至细胞密度100x10⁵细胞/ml时，机械运动速度增加10rpm。

在一个实施方式中，机械运动的速度进一步调节如下：

v)维持机械运动速度在200rpm至210rpm之间，逐步降低机械运动速度至135rpm，并保持该速度不变直到培养完成。