[发明专利]筛选高亲和力抗体的方法

说明书

本发明报告了基于抗体的热力学参数确定高亲和力抗体的方法，特别是基于过渡态的热力学评估结合熵，例如标准缔合结合熵(associationbinding entropy，)和在抗原结合步骤过程中的熵负荷。

发明背景

产生具有卓越的抗原特异性和超乎寻常的抗原复合体稳定性的高亲和力抗体是诊断和治疗抗体开发的主要目标。

关于蛋白质-蛋白质相互作用的热力学分析，最常用的技术是量热法测定(Chaires，J.B.，Annu.Rev.Biophys.37(2008)135-51；Perozzo，R.等人，J.Recept.Signal Transduct.Res.24(1-2)(2004)1-52；Li，L.等人，Chem.Biol.Drug Des.71(6)(2008)529-32；Liang，Y.，Acta Biochim.Biophys.Sin.(Shanghai)40(7)(2008)565-76；Thielges，M.C.等人，Biochemistry 47(27)(2008)7237-47)。反应量热确定所需的样品量高，例如至少125μg/ml的抗体浓度和至少150μl的样品体积。此外，反应量热法需要高的样品纯度且不耐受任何样品杂质或样品异质性，样品缓冲液直接影响获得的热力学参数的结果。反应量热法仅能够解析平衡热力学。

表面等离振子共振(SPR)仪器测量(Roos，H.等人，J.Mol.Recognit.11(1-6)(1998)204-10；Van Regenmortel，M.H.等人，J.Mol.Recognit.11(1-6)(1998)163-7；Gunnarsson，K.，Curr.Protoc.Immunol，第18章，(2001)Unit 18.6；Drake，A.W.等人，Anal.Biochem.328(1)(2004)35-43；Kikuchi，Y.等人，J.Biosci.Bioeng.100(3)(2005)311-7)允许以高通量方式快速测定温度依赖性动力学谱(参见例如，Canziani，G.A.等人，Anal.Biochem.325(2)(2004)301-7；Safsten，P.等人，Anal.Biochem.353(2)(2006)181-190；Leonard，P.等人，J.Immunol.Methods 323(2)(2007)172-9)。

Wassaf.D.等人(Anal.Biochem.351(2006)241-253)报道了利用表面等离振子共振微阵列高通量亲和排列抗体。Roos，H.等人，J.Mol.Recognit.11(1998)204-210中报道了利用生物传感技术进行蛋白质相互作用的热力学分析。

发明概述

本发明提供了利用温度不依赖性抗原复合体稳定性选择高亲和力抗体的方法，特征是焓驱动的抗原缔合，负的熵负荷和在抗原解离过程中大的熵改变。

本发明的第一个方面是从结合抗原的多个抗体中选择抗体的方法，所述方法包括下列步骤：

-基于抗原的分子量优化表面等离振子共振测定中的信号应答，从而在测定的温度范围内保持R_max值恒定，

-实施动力学筛选步骤，包括根据通式(I)基于表面等离振子共振测定计算抗原复合体稳定性

(I)抗原复合体稳定性＝(1-[BL(RU)-SL(RU)/BL(RU)])

BL表示设置在抗原注射终点不久前的结合晚期(Binding Late)参照点，SL表示设置在复合体解离期终点不久前的稳定性晚期(Stability Late)参照点，

-选择具有大于95％复合体稳定性的抗体，

-在17℃、21℃、25℃、29℃、33℃和37℃，通过表面等离振子共振确定温度依赖性动力学数据，

-计算过渡态热力学性质，

-基于温度依赖性增加的抗原复合体缔合速率常数K_a[1/Ms]，以及保留的或降低的抗原复合体解离速率常数k_d[1/s]选择抗体。

在该方面的一个实施方案中，

-基于表面等离振子共振测定和利用热力学筛选计算所述抗体的热力学性质，来产生温度依赖性动力学数据，所述热力学筛选是在17℃用107nM、在21℃用78nM、在25℃用70nM、在29℃用64nM、在33℃用58nM和在37℃用53nM的抗体浓度来实施的，和/或

-热力学性质是焓驱动的抗原复合体缔合期和低于10J/K＊mol的结合熵和/或