[发明专利]靶核酸序列的扩增方法、使用该方法的突变检测方法、以及用于该方法的试剂

说明书

技术领域

本发明涉及靶核酸序列的扩增方法，所述靶核酸序列包含发生作为检测目标的突变的碱基位点，使用该方法的突变检测方法，以及用于该方法的试剂。

背景技术

在所有疾病的预防和治疗中，以单核苷酸多态性(SNP)为代表的基因突变的检测正在广泛进行。例如，在癌细胞的基因中观察到许多突变，已知这些突变与细胞的癌化有关。因此，认为通过检测细胞中的基因的突变，能够确认癌化的可能性和恶化程度等，在治疗中是非常有用的信息。另外，还报道有在药物治疗中癌细胞的基因出现显示耐药性的突变。通过该突变的检测，能够判断药物对于各患者的有效性，因而能进行更适合的治疗。例如，慢性髓性白血病(CML)广泛使用了抗癌剂伊马替尼(imatinib)的给药治疗，但认为bcr-abl基因上的突变(例如，T315I)影响耐药性。这样，基因中的突变的检测对于临床领域中的早期发现和治疗是有用的，因而要求较高的可靠性。

作为基因中的突变的检测方法，通常已知直接测序法、ASP(等位基因特异性引物)-PCR(聚合酶链反应)法(专利文献1)、Tm(熔解温度)分析法(非专利文献1)。所述直接测序法为扩增包含作为检测目标的碱基位点的区域，并对所获得的扩增产物的碱基序列进行分析的方法。所述ASP-PCR法为如下方法：使用与包含作为检测目标的碱基位点的区域互补、且在3’末端区域具有与所述检测目标的碱基位点的碱基互补的碱基的引物来进行PCR，根据扩增的有无而判断突变。根据该方法，例如，在使用与将所述检测目标的碱基位点设定为突变型碱基的序列(以下，也称为“突变序列”)互补的引物时，能够通过扩增的检测来确认突变。另外，在使用与将检测目标的碱基位点设定为正常型碱基的序列(以下，也称为“正常序列”)互补的引物时，能够通过扩增的检测来确认非突变(即正常)。所述Tm分析首先对包含所述检测目标的碱基位点的区域进行扩增，并形成所得到的扩增产物和与所述突变序列互补的探针的杂交体(双链DNA)。并且，对该杂交产物实施加热处理，通过吸光度等的信号测定来检测伴随温度上升的杂交体的解离(熔解)，确定Tm值。由此，判断突变的有无。在构成杂交产物的各链为匹配时Tm值升高，在为错配时Tm值降低。因此，对所述突变序列和与其互补的探针的杂交产物，预先求得Tm值(评价基准值)，并通过比较该评价基准值与前述确定的Tm值(测定值)，能够进行如下判断。若所述测定值与所述评价基准值相同，则判断为完全匹配，即，所述检测目标的碱基位点存在突变。另一方面，若所述测定值低于所述评价基准值，则判断为错配，即，所述检测目标的碱基位点为正常(不存在突变)。

然而，所述直接测序法的灵敏度较低，而且操作需要花费大量的劳力和时间。所述ASP-PCR法虽然灵敏度优异，但存在特异性欠佳的问题。即，在使用与所述突变序列互补的引物时，即便不存在突变，但可能会确认到扩增，判断为假阳性。另外，在所述ASP-PCR法中，在1个反应体系中，仅能够使用与所述突变序列互补的引物和与所述正常序列互补的引物中的任一者。因此，为了确认检测目标的碱基位点是正常还是突变，需要对使用与所述突变序列互补的引物的反应体系和使用与所述正常序列互补的引物的反应体系这2种体系进行PCR。这样，由于使用2种反应体系，因而会花费操作的劳力和时间、成本。此外，即便使用2种反应体系，也存在难以进行可靠性足够优异的判断的问题。即，在2种反应体系当中，在使用了与所述正常序列互补的引物的反应体系中未确认到扩增、而仅在使用了与所述突变序列互补的引物的反应体系中确认到扩增的情况下，能够判断为真正的阳性。然而，在两者的反应体系中均观察到扩增时，依然难以判断为正常还是为突变。另一方面，由于所述Tm分析法的特异性优异，因而能够避免假阳性的问题，而且，在1个反应体系中能够判断所述检测目标的碱基位点为正常还是为突变。然而，Tm分析法存在灵敏度不充分的问题。

尤其是，如前所述，在对于癌检测突变的情况下，在由患者采集的待测体中混杂有目标基因发生突变的细胞和正常的细胞。因此，例如，对于包含大量正常基因和少量突变基因的生物体试样，也要求能够正确地检测突变的有无。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第2853864号

非专利文献

非专利文献1：Analytical Biochemistry 290，89-97(2001)

发明内容

发明要解决的问题