[发明专利]靶核酸序列的扩增方法、使用该方法的突变检测方法、以及用于该方法的试剂

权利要求书

1.一种靶核酸序列的扩增方法，其特征在于，其为模板核酸中的靶核酸序列的扩增方法，

所述靶核酸序列为所述模板核酸中包含发生作为检测目标的突变的碱基位点的序列，

该方法包括如下扩增工序：在同一反应体系中，与所述碱基位点为正常型碱基的靶核酸序列相比，优先扩增所述碱基位点为突变型碱基的靶核酸序列。

2.根据权利要求1所述的靶核酸序列的扩增方法，其中，所述扩增工序为在所述同一反应体系中使用下述引物(Xmt)和引物(Xwt)扩增所述靶核酸序列的工序，

下述引物(Xmt)对所述碱基位点为突变型的模板核酸的扩增效率高于下述引物(Xwt)对所述碱基位点为正常型的模板核酸的扩增效率，

引物(Xmt)：

为与所述模板核酸中包含突变型的所述碱基位点的区域互补、且3’区域具有与所述碱基位点的碱基互补的碱基的引物，

引物(Xwt)：

为与所述模板核酸中包含正常型的所述碱基位点的区域互补、且3’区域具有与所述碱基位点的碱基互补的碱基的引物。

3.根据权利要求2所述的靶核酸序列的扩增方法，其中，在所述引物(Xmt)和引物(Xwt)中，3’末端的第1位或第2位的碱基为与所述碱基位点的碱基互补的碱基。

4.根据权利要求2所述的靶核酸序列的扩增方法，其中，所述引物(Xmt)与互补序列的Tm值为比所述引物(Xwt)与互补序列的Tm值更高的值。

5.根据权利要求1所述的靶核酸序列的扩增方法，其中，所述扩增工序为在所述同一反应体系中使用下述引物(Xmt)和引物(Y1)扩增所述靶核酸序列的工序，

引物(Xmt)：

为与所述模板核酸中包含突变型的所述碱基位点的区域互补、且3’区域具有与所述碱基位点的碱基互补的碱基的引物，

引物(Y1)：

为与所述模板核酸中位于所述碱基位点的3’侧的区域互补的引物。

6.根据权利要求2或5所述的靶核酸序列的扩增方法，其中，在所述扩增工序中，一并使用下述引物(Y2)，

引物(Y2)：

为与所述模板核酸中位于所述碱基位点的5’侧的区域的互补序列互补的引物。

7.根据权利要求1所述的靶核酸序列的扩增方法，其中，在所述扩增工序中，向所述反应体系进一步添加能够与所述模板序列中包含所述碱基位点的序列杂交的探针。

8.根据权利要求7所述的靶核酸序列的扩增方法，其中，所述探针为标记探针。

9.一种突变的检测方法，其特征在于，其为检测模板核酸中的作为检测目标的碱基位点有无突变的方法，其包含下述(a)～(c)工序：

(a)通过权利要求1所述的靶核酸序列的扩增方法在反应体系中扩增所述模板核酸中包含所述碱基位点的靶核酸序列的工序；

(b)在能够与所述模板核酸中包含所述碱基位点的序列杂交的探针的存在下，改变包含由所述(a)工序得到的扩增产物的所述反应体系的温度，测定显示所述扩增产物与所述探针的杂交产物的熔解状态的信号值的工序；

(c)由与温度变化相伴的所述信号值的变动来确定所述目标碱基位点有无突变的工序。

10.根据权利要求9所述的突变的检测方法，其中，所述扩增工序为在所述同一反应体系中使用下述引物(Xmt)和引物(Xwt)扩增所述靶核酸序列的工序，

下述引物(Xmt)对所述碱基位点为突变型的模板核酸的扩增效率高于下述引物(Xwt)对所述碱基位点为正常型的模板核酸的扩增效率，

引物(Xmt)：

为与所述模板核酸中包含突变型的所述碱基位点的区域互补、且3’区域具有与所述碱基位点的碱基互补的碱基的引物，

引物(Xwt)：

为与所述模板核酸中包含正常型的所述碱基位点的区域互补、且3’区域具有与所述碱基位点的碱基互补的碱基的引物。

11.根据权利要求10所述的突变的检测方法，其中，在所述引物(Xmt)和引物(Xwt)中，3’末端的第1位或第2位的碱基为与所述碱基位点的碱基互补的碱基。

12.根据权利要求10所述的突变的检测方法，其中，所述引物(Xmt)与互补序列的Tm值为比所述引物(Xwt)与互补序列的Tm值更高的值。