[发明专利]因子IX的定点修饰

说明书

本申请要求2008年4月16日提交的美国临时申请流水号61/124,568的权益，通过参考而将其内容完整收入本文。

发明领域

本发明涉及经修饰的因子IX(factor IX)多肽，诸如具有一个或多个引入的半胱氨酸位点的因子IX多肽。可以将经修饰的因子IX多肽与生物相容性聚合物偶联。本发明还涉及生成经修饰的因子IX多肽的方法，和使用经修饰的因子IX多肽例如来治疗罹患血友病(hemophilia)B的患者的方法。

发明背景

血友病B影响着34,500名男性中的一名，并且是由编码凝固因子IX(FIX)的基因的多种遗传缺陷引起的，所述遗传缺陷导致血液中低的或检测不到的FIX蛋白(Kurachi等，Hematol.Oncol.Clin.North Am.6：991-997，1992；Lillicrap，Haemophilia 4：350-357，1998)。不足水平的FIX导致有缺陷的凝固和源自不受控制的出血的症状。通过静脉内输注血浆衍生的或重组的FIX蛋白以停止已经启动的出血或阻止出血发生(预防)来有效地治疗血友病B(Dargaud等，Expert Opin.Biol.Ther.7：651-663；Giangrande，Expert Opin.Pharmacother.6：1517-1524，2005)。有效的预防要求维持约1％正常水平的最低谷水平的FIX(Giangrande，Expert Opin.Pharmacother.6：1517-1524，2005)。由于约18至24小时的天然FIX(血浆衍生的或重组的)半衰期，FIX水平在推注后3至4天内下降至正常水平的小于1％，这使平均每三天重复注射成为必要以实现有效的预防(Giangrande，Expert Opin.Pharmacother.6：1517-1524，2005)。此类频繁的静脉内注射对于患者而言是成问题的，而且是实现有效预防的一项障碍(Petrini，Haemophilia 13 Suppl 2：16-22，2007)，尤其在儿童中。具有较长半衰期的FIX蛋白会实现较小频率的施用，并且如此是有显著医学益处的。

发明概述

本申请的一方面提供了FIX多肽(也指经修饰的FIX多肽或FIX变体)，其包含已经通过引入一个或多个聚合物偶联位点(例如游离的半胱氨酸残基)来修饰过的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含至少一处选自R338A和V86A的突变和至少一选自下组的半胱氨酸取代：T148C、V153C、T163C、L165C、N167C、T169C、T172C、F175C、K201C、K247C、K413C、L414C、和T415C。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含至少一处选自R338A和V86A的突变和至少一处选自下组的半胱氨酸取代：T148C、V153C、T163C、L165C、T172C、F175C、K247C、L414C、和T415C。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含T169C、K201C、K247C、或L414C取代或与R338A、V86A、或R338A和V86A两者组合的T169C、K201C、K247C、或L414C取代。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含在氨基酸残基160-164之间引入的至少一个半胱氨酸氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含在氨基酸残基160-164之间引入的至少2、3、4、或5个半胱氨酸氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含残基A161与E162之间插入的单个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含与R338A、V86A、或R338A和V86A两者组合的在残基A161与E162之间插入的单个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含在氨基酸残基160-161之间引入的至少一个半胱氨酸氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含在氨基酸残基161-162之间引入的至少一个半胱氨酸氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含在氨基酸残基162-163之间引入的至少一个半胱氨酸氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含在氨基酸残基163-164之间引入的至少一个半胱氨酸氨基酸。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽包含本文中所描述的突变的组合。

在一些实施方案中，所述经修饰的多肽具有凝固活性。在一些实施方案中，所述多肽包含至少一处选自R338A和V86A的突变。在一些实施方案中，所述多肽包含R338A和V86A突变两者。