[发明专利]用于生产生物分子的方法和设备

说明书

技术领域

本发明涉及生产生物分子，特别是多核苷酸例如质粒DNA的领域。特别地，本发明涉及温和的澄清步骤，其利用通过产生气体气泡(无气体/空气的喷射)来调节的先进的漂浮方法(floatation method)。本发明特别适合于工业规模的方法，其包括以下步骤：在碱条件下的细胞溶胞，之后的中和以及随后的细胞溶胞产物的澄清，而所有这些步骤以完全连续方式运行。

发明背景

在二十世纪最后二十五年以及二十一世纪初，在分子和细胞生物学上的发展导致用于生产重组生物分子(生物聚合物)的新技术的产生。这组大分子包括，例如蛋白质、核酸和多糖。它们越来越多地用于人类的卫生保健、用于疾病的诊断、预防和治疗领域。

近年来，在诊断、基因治疗和核酸疫苗领域中用多核苷酸取得了一些最具革命性的进步。这些应用的共同之处在于，将DNA引入到细胞中，特别是将染色体外DNA或RNA引入到细胞中以辅助诊断、治疗或预防的效果。

多核苷酸有代表性的成员为信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)、基因组DNA(gDNA)或染色体DNA(cDNA)、以及质粒DNA(pDNA)。这些大分子可以是单链或双链的。

根据其大小和形状，多核苷酸对于酶降解(DNA酶和RNA酶)和剪切力是敏感的。尤其是染色体DNA，当处于其变性形式和纠缠形式(entangled form)时，其对于机械压力非常敏感，产生与pDNA具有相似性质的片段。对于暴露在剪切力下的期间，这一点变得越来越重要(Ciccolini LAS，Shamlou PA，Titchener-Hooker N，Ward JM，Dunnill P(1998)Biotechnol Bioeng 60：768；Ciccolini LAS，Shamlou PA，Titchener-Hooker N(2002)Biotechnol Bioeng 77：796)。

质粒(pDNA)是双链的染色体外环状多核苷酸。大部分药物用质粒的大小范围为3～10kbp，相当于2×10⁶～7×10⁶的分子量且其具有的旋转半径为100nm或更高(Tyn M，Gusek T(1990)Biotech.Bioeng.35：327)。有报道显示在某些情况下，多顺反子/多价质粒大于20kbp，其编码几个不同的蛋白质(Müller PP，Oumard A，Wirth D，A，Hauser H，in：Schleef M(2001)Plasmids for Gene Therapy and Vaccination，Wiley-VCH，Weinheim，p119)。可以区分pDNA的不同拓扑形式。超螺旋(sc)或共价闭合环状(ccc)形式被认为对于治疗用途是最稳定的，因此其是所期望的形式。其它的拓扑pDNA形式是从ccc形式通过单链切口(开环的或oc)或双链切口(线性的)而产生，或者由接合产生。物理的、化学的或酶的活性可以引起链的断裂。对于治疗用途而言，ccc形式的比例是用于评价pDNA制品质量的主要参数。

在基因治疗和遗传疫苗领域，不断增加的临床试验数量反映出pDNA的潜在优点。目前，还观察到根据cGMP规则生产药物级pDNA的需求在持续不断的增加。特别是针对基于pDNA的疫苗(pDNA-based vaccine)的市场供应，预计确定每年将需要许多克或甚至几千克的经纯化的pDNA。因此，需要可以在工业规模上运行的过程。这些生产过程必须满足规章的要求(例如FDA，EMEA)，并应当是经济上可行的和必须是具有生产性和耐用的。

以往，已经开发出的大部分生物技术生产过程是用于生产经纯化的重组蛋白质的。由于多核苷酸和蛋白质在物理-化学性质上存在不同，这些方法难以适用于多核苷酸的生产。建立了基于传统实验室规模实验设计的生产过程的制造业者，面临涉及生产性、可规模化以及产品的成本(COGS)方面的越来越多严格的限制。因此，需要可以用于多核苷酸的方法，特别是用于在制造业规模生产pDNA的方法。

简言之，用于生产不被宿主分泌的重组生物分子的过程，特别是pDNA和大蛋白质，其步骤如下：

a)发酵(培养携带有目标生物分子的细胞以及任选从发酵液中收获所述细胞)，

b)细胞破碎(从细胞中释放目标生物分子)，

c)分离和纯化(从杂质中分离出目标生物分子)。

更为具体地，上述这些步骤的特征在于用于多核苷酸的生产，特别是用于生产pDNA，如下所述。